ER exit sitesの構造形成・機能発現制御機構の解明

阐明内质网出口位点的结构形成和功能表达控制机制

• 批准号: 18050010
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 4.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18050010/
• 关键词: 小胞体; セミインタクト細胞; オルガネラ; 可視化; ゴルジ体; 小胞輸送; 再構成

ER exit sites(ERES)は、小胞体(ER)からゴルジ体へ向かう輸送小胞の形成プラットフォームである。われわれは先行研究により、膜タンパク質であるYip1AをERESのマーカー膜タンパク質とし、M期におけるERES構造体分解の制御機構を明らかにしている。しかし、本研究実施の過程で、Yip1AはGFP-tag依存的にERESの存在し、多くはゴルジ体に局在化することを発見した。そこで、本研究では、ゴルジ体におけるYip1Aの機能探索を中心に研究を進めた。そのため、小胞体-ゴルジ体間の小胞輸送(順行輸送と逆行輸送)をゴルジ体に局在化するGT-GFP(ガラクトシルトランスフェラーゼのGFP融合タンパク質)をプローブとしFRAP法を用いてそのキネティックスを含めて定量的に解析する手法を構築した。次に、セミインタクト細胞内で細胞質依存的に生起する小胞体→ゴルジ体間輸送(順行輸送)とゴルジ体→小胞体間輸送(逆行輸送)素過程を分割してアッセイする方法を構築した。次に、Yip1Aの細胞質ドメインのペプチド領域(N末から1-109番目)及び(1-65番目)部分のGST融合タンパク質を調製し、細胞質とともにセミインタクトCHO細胞に加えて順行・逆行輸送アッセイを行った。その結果、興味深いことに、逆行輸送のみがそれらペプチドにより有意に阻害されることが判った。これは、Yip1Aの細胞質側ドメインが細胞質またはゴルジ体表面の輸送装置に作用して、ゴルジ体からのGT-GFPの逆行輸送を競争的に阻害したことを意味する。この他にも、この細胞質ペプチド領域は、VTC/ERGICからのp58の逆行輸送を阻害しなかったこと,RNAi法によりHeLa細胞の内在性のYip1AをノックダウンするとShigatoxinのエンドソーム→ゴルジ体→小胞体の逆行輸送が阻害されることなどから、Yip1Aはゴルジ体からのCOPI依存的な逆行輸送に関わることを示唆する結果を得た(論文投稿中)。

ER exit sites (ERES) は, small cell body (ER) か ら ゴ ル ジ body へ to か う conveying vesicular の form プ ラ ッ ト フ ォ ー ム で あ る. わ れ わ れ は leading research に よ り, membrane タ ン パ ク qualitative で あ る Yip1A を ERES の マ ー カ ー membrane タ ン パ ク qualitative と し, M phase に お け る ERES decomposition の system constructs the royal institution を Ming ら か に し て い る. し か し process, this study be の で, Yip1A は GFP - tag dependent に ERES の し, more く は ゴ ル ジ body に bureau in turn す る こ と を 発 see し た. そ こ で, this study で は, ゴ ル ジ body に お け る Yip1A の function を に を center study into め た. そ の た め, small cell body - ゴ ル between ジ の vesicular transport (anterograde と retrograde transportation) を ゴ ル ジ body に bureau in turn す る GT - GFP (ガ ラ ク ト シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の GFP fusion タ ン パ ク qualitative) を プ ロ ー ブ と し を FRAP method with い て そ の キ ネ テ ィ ッ ク ス を containing め て quantitative analytical す に る gimmick を build し た. に, セ ミ イ ン タ ク で ト cell cytoplasm dependent に arise す る small cell body - ゴ ル conveyor (anterograde transport) between ジ と ゴ ル ジ body - transport between small cell body (retrograde transport), process を segmentation し て ア ッ セ イ す を る method to construct し た. に, Yip1A の cytoplasm ド メ イ ン の ペ プ チ ド area (at the end of the N か ら time 1-109 mesh) and び (1-65's eye) の GST fusion タ ン パ ク を し modulation, cytoplasm と と も に セ ミ イ ン タ ク ト に CHO cells with え て, anterograde retrograde transport ア ッ セ イ を line っ た. Youdaoplaceholder0 そ result, deep interest, とに とに, reverse transportation, <s:1> みがそれらペプチドによ and intentional に obstruction, される とが とが are judged as った. こ れ は, Yip1A の cytoplasmic side ド メ イ ン が cytoplasm ま た は ゴ ル ジ body surface の conveyer に role し て, ゴ ル ジ body か ら の GT - GFP の retrograde transport を competition に resistance against し た こ と を mean す る. こ の he に も, こ の cytoplasm ペ プ チ ド は, VTC group/ERGIC か ら の p58 の retrograde transport を resistance against し な か っ た こ と, RNAi method に よ り HeLa の internality の Yip1A を ノ ッ ク ダ ウ ン す る と Shigatoxin の エ ン ド ソ ー ム - ゴ ル ジ body and small cell body の retrograde transport が resistance against さ れ る こ と な ど か ら, Yip1A は ゴ ル ジ body か ら の COPI dependent な retrograde transport に masato わ る こ と を in stopping す る results た を (in paper submitted).

项目成果

ER stress induces ER-Golgi trafficc and surface expression of mutant ABCA1-GFP in HEK293 cells

内质网应激诱导 HEK293 细胞中内质网-高尔基体运输和突变型 ABCA1-GFP 的表面表达

• 发表时间: 2006
• 作者: Toyama R.;Nabeshima Y.;Tsuji Y.;Fujimori T.;Nabeshima Y.;有坂 文雄;Motohiro Nonaka;上田 晴子;Arowu R. Tanaka
• 通讯作者: Arowu R. Tanaka

Subcellular localization and physiological significance of intracellular mannan-binding protein

• DOI: 10.1074/jbc.m700992200
• 发表时间: 2007-06-15
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Nonaka, Motohiro;Ma, Bruce Yong;Kawasaki, Toshisuke
• 通讯作者: Kawasaki, Toshisuke

Myt1 protein kinase is essential for Golgi and ER assembly during mitotic exit

• DOI: 10.1083/jcb.200708176
• 发表时间: 2008-04-07
• 期刊: JOURNAL OF CELL BIOLOGY
• 影响因子: 7.8
• 作者: Nakajima, Hiroyuki;Yonemura, Shigenobu;Nishida, Eisuke
• 通讯作者: Nishida, Eisuke

小胞輸送素過程に関わるキナーゼネットワーク可視化解析システムの構築

囊泡转运元件过程中激酶网络可视化分析系统的构建

• 发表时间: 2007
• 作者: Imura A.;Tsuji Y.;Murata M.;Maeda R. Kubota K.;Iwano A.;Obuse C.;Togashi K.;Tominaga M.;Kita N.;Tomiyama K.;Iijima J.;Nabehsima Y.;Fujioka M.;Asato R.;Tanaka S.;Kojima K.;Ito J.;Nozaki K.;Hashimoto N.;Ito T.;Nishio T.;Uchiyama T.;Fuj;駒田 雅之;島田 貴士;安達淳博
• 通讯作者: 安達淳博

The ABCA1 Q597R mutant undergoes trafficking from the ER upon ER stress.

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2008.03.018
• 发表时间: 2008-05
• 期刊: Biochemical and biophysical research communications
• 影响因子: 3.1
• 作者: Arowu R. Tanaka;F. Kano;K. Ueda;M. Murata