セミインタクト細胞系を利用した細胞ストレス応答に関わる翻訳制御機構の解明

使用半完整细胞系阐明细胞应激反应中涉及的翻译控制机制

• 批准号: 16657053
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 1.98万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16657053/
• 关键词: 細胞ストレス; リン酸化; 翻訳制御; 可視化; セミインタクト細胞; 核移行; mRNA; 生体シミュレーション; GFP可視化; 小胞体ストレス; タンパク質の一生; 酸化ストレス; DNAチップ

本研究では小胞体ストレスや酸化ストレス等の多様な細胞ストレス付加によって翻訳制御を受けている転写因子ATF4の翻訳制御機構を明らかにするため、ストレス依存的に細胞質内にできてくるストレスグラヌルとATF4のmRNAの相互作用について研究を行った。目的のmRNAを生きた細胞内で可視化するためMS2-tag法を利用した。ATF4、アクチン及び膜タンパク質CD4のmRNAの3‘末端にMS2-配列を挿入したプラスミドとGFP-MS2融合タンパク質のプラスミドをCHO細胞に通常の方法で同時にtransfectionした。この時、GFP-MS"タンパク質には核移行シグナルを挿入し、細胞質内でMS2-tag付きmRNAと結合できなかったGFP-MS2は核へ移行し、細胞質内のmRNAが観察しやすいように工夫した。その結果、生きたCHO細胞内において、ATF4、アクチン及びCD4のmRNAの動態を可視化することに成功した。興味深いことに、アクチンmRNAは細胞底面の周縁部のアクチンフィラメントに沿って局在し、ストレス負荷時にもその局在に影響はなかった。ATF4-mRNAは細胞質全体に散在していたが、ストレス負荷によってもその局在に変化はなかった。これに反し、CD4-mRNAは、ストレス負荷により局在を細胞質からストレスグラニュルに大きく変化させた。これらの結果より、ストレス負荷時に翻訳活性化されるATF4は、細胞質に残り、通常翻訳抑制を受けるCD4等のタンパク質はストレスグラニュルにmRNAが集積し翻訳阻害されると予想された。アクチン等ストレス負荷によって翻訳制御を受けないタンパク質も、そのmRNAの局在を変化させない仕組みがあることが判った。このmRNAの可視化システムは、mRNAのストレスグラニュル局在化による翻訳制御メカニズム解明のための基本アッセイ系となることが判った。

In this study, the multi-cell sterilization of small cell body sterilization sterol and others was carried out. The control mechanism of adding the factor ATF4を明らかにするため、ストレスdepends on the にcytoplasmic にできてくるストレスグラヌルとATF4のmRNAのInteraction Research を行った. The aim is to visualize intracellular mRNA by using the MS2-tag method. ATF4, アクチン and び membrane タンパク plasmid CD4 のmRNA の3' terminal MS2-alignment を insertion したプラスミドとG FP-MS2 is a common method of fusion of DNA-containing CHO cells and simultaneous transfection. When the time comes, GFP-MS "タンパク性には" is transferred to the nucleus and inserted into the nucleus, and the MS2-tag attached to the mRNA in the cytoplasm is combined into the nucleus of GFP-MS2へmigration し, cytoplasm of mRNA が観看しやすいように工夫した.のdynamic をvisualization することにsuccessfulした. Interesting depth of interest, アクチンmRNA, cell bottom surface, week 縁BU, のアクチンフィラThe メントにって round is in し, and the ストレス load is affected by the にもその round in にはなかった. ATF4-mRNA is dispersed throughout the cytoplasm, and the load of ATF4-mRNA is dispersed in the cytoplasm.これにAnti-し, CD4-mRNA は, ストレス load により localization in をcytoplasmic からストレスグラニュルに大きく変化させた.これらのRESULTS より, ストレス load-activated にATF4は, cytoplasmic residual り, normal translation Inhibition of CD4, etc., and other substances, such as CD4, etc. I think of it.アクチン Waiting for the ストレス load によってturn訳control をReceived けないタンパク性も.このmRNA visualization システムは、mRNA のストレスグラニュルbureau in The basic アッセイ system is the となることがadjusted った.

项目成果

セミインタクト細胞アッセイ系の構築

半完整细胞检测系统的构建

• 发表时间: 2004
• 期刊: 実験医学 Vol.20(No.16)
• 作者: Kano;F.;山内忍;村田昌之;Fumi Kano;Fumi Kano;Satomi Nadanaka;加納ふみ
• 通讯作者: 加納ふみ

EGF signalling amplification induced by dynamic clustering of EGFR

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.09.173
• 发表时间: 2004-11-19
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: Ichinose, J;Murata, M;Sako, Y
• 通讯作者: Sako, Y

NSF/SNAPs and p97/p47/VCIP135 are sequentially required for cell cycle-dependent reformation of nthe ER network

NSF/SNAP 和 p97/p47/VCIP135 是 ER 网络的细胞周期依赖性重组所必需的

• 发表时间: 2005
• 期刊: Genes to Cells 10
• 作者: Kano;F.
• 通讯作者: F.

The maintenance of the ER netwrok is regulated by p47,a cofactor of p97,through phosphorylation by cdc2 kinase

ER 网络的维持由 p47（p97 的辅助因子）通过 cdc2 激酶磷酸化来调节

• 发表时间: 2005
• 期刊: Genes to Cells (in press)
• 作者: Kano;F.;山内忍;村田昌之;Fumi Kano
• 通讯作者: Fumi Kano

セミインタクト細胞アッセイ

半完整细胞测定

• 发表时间: 2005
• 期刊: リボソーム応用の新展開 人工細胞の開発に向けて(秋吉一成, 辻井薫監修)(NTS出版)
• 作者: Kano;F.;山内忍;村田昌之
• 通讯作者: 村田昌之