セミインタクト上皮細胞を用いたタイトジャンクション構造形成制御メカニズムの解明

使用半完整上皮细胞阐明紧密连接结构形成的控制机制

• 批准号: 19657057
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19657057/
• 关键词: 細胞接着; 可視化; 膜タンパク質; セミインタクト細胞; シグナル伝達

マウス・クローディン(CL3)依存的な細胞-細胞間接着を撹乱するキナーゼ阻害剤を網羅的に可視化スクリーニングした。そのため、上皮系培養細胞・Eph4にクローディン-YFP(CL3-YFP)を恒常的に発現するstable transfectan t (Eph4-CL3-YFP)を樹立した。96wellプレートの各wellに、コンフルエントに培養したEph4-CL3-YFP細胞に対し、10μM及び100μMの二種類の濃度のキナーゼ阻害剤ライブラリー(90種類のキナーゼ阻害剤のライブラリー)を、1時間または3時間、37℃でインキュベーションした後の細胞間接着(網目状の細胞接着像)の様子を観察した。観察にはINCell Analyzer (GEヘルスケア社)を用い、各wellから任意の5点を選択し、画像の取得及び解析に供した(ハイスループット可視化スクリーニング)。又、同時に、CL3-YFPの裏打ちタンパク質・ZO-1(内在性)の様子を間接蛍光抗体法により観察し、CL3-YFPの画像と並び比べることにより真に細胞接着のみが撹乱するキナーゼ阻害剤を抽出することができた。その結果、CL3/ZO-1構造の両構造が撹乱を受けるキナーゼ阻害剤(PKC阻害剤を含む9種類)、CL3構造のみが攪乱するキナーゼ阻害剤(1種類)、ZO-1構造のみが撹乱するキナーゼ阻害剤(5種類)を得た。さらに、これらの阻害剤に対し、キナーゼ阻害剤処理濃度、処理時間などを様々に変化させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞接着部分を詳細に観察・検討した結果、細胞-細胞間接着のみに効果を示し、かつ、細胞-基質間接着に影響を与えないキナーゼ阻害剤として、CL3/ZO-1の両構造共に攪乱する阻害剤2種、CL3構造のみ攪乱するもの1種、ZO-1構造のみ攪乱するもの2種を絞り込むことができた。

The cell-to-cell interaction depends on whether the cell is in contact with the target cell or not. Eph4-CL3-YFP(CL3-YFP) was established as a stable transfection agent in cultured epithelial cells. 96-well culture of Eph4-CL3-YFP cells at concentrations of 10μM and 100μM (90-species), 1-time, 3-time, 37 ° C, intercellular adhesion (mesh-like cell adhesion). Check INCell Analyzer (GE) for any 5-point selection, image acquisition and analysis. In addition, CL3-YFP's internal control system, ZO-1(intrinsic) component, indirect light antibody method, CL3-YFP's image and ratio, true cell and subsequent disturbance, and extraction of harmful components. The results show that the structure of CL3/ZO-1 structure is disturbed, and the resistance agent (PKC resistance agent) contains 9 kinds. The structure of CL3 structure is disturbed, and the resistance agent (1 kind). The structure of ZO-1 structure is disturbed, and the resistance agent (5 kinds) is obtained. In addition, the effects of different inhibitors on cell-to-cell adhesion were investigated in detail by confocal microscopy. The effects of different inhibitors on cell-to-cell adhesion were investigated. The effects of different inhibitors on cell-to-matrix adhesion were investigated. The structure of CL3/ZO-1 was mixed with two inhibitors. There are two kinds of structural disturbance: CL3 and ZO-1.

项目成果

細胞内における生体物質の局在制御関連酵素の特定方法

与细胞内生物物质的定位控制相关的酶的鉴定方法

• 发表时间: 2008

Visual screening for and analysis of Glycogen synthetase kinase 3 β-regulated membrane traffcking pathway that are involved in extensive β-amyloid secretion

目视筛选和分析参与广泛 β-淀粉样蛋白分泌的糖原合成酶激酶 3 β 调节的膜运输途径

• 发表时间: 2009
• 期刊: Gens to Cells (印刷中)
• 作者: 佐々木保典;ら;廣瀬哲郎;Atsuhiro Adachi
• 通讯作者: Atsuhiro Adachi

Formation of cholesterol-enriched structures by aberrant intracellular accumulation of ABCAl

通过ABCA1异常细胞内积累形成富含胆固醇的结构

• 发表时间: 2008
• 期刊: Genes to Cells 13
• 作者: Tanaka;R;Arowu
• 通讯作者: Arowu