セミインタクト上皮細胞を用いたタイトジャンクション構造形成制御メカニズムの解明

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マウス・クローディン(CL3)依存的な細胞-細胞間接着を撹乱するキナーゼ阻害剤を網羅的に可視化スクリーニングした。そのため、上皮系培養細胞・Eph4にクローディン-YFP(CL3-YFP)を恒常的に発現するstable transfectan t (Eph4-CL3-YFP)を樹立した。96wellプレートの各wellに、コンフルエントに培養したEph4-CL3-YFP細胞に対し、10μM及び100μMの二種類の濃度のキナーゼ阻害剤ライブラリー(90種類のキナーゼ阻害剤のライブラリー)を、1時間または3時間、37℃でインキュベーションした後の細胞間接着(網目状の細胞接着像)の様子を観察した。観察にはINCell Analyzer (GEヘルスケア社)を用い、各wellから任意の5点を選択し、画像の取得及び解析に供した(ハイスループット可視化スクリーニング)。又、同時に、CL3-YFPの裏打ちタンパク質・ZO-1(内在性)の様子を間接蛍光抗体法により観察し、CL3-YFPの画像と並び比べることにより真に細胞接着のみが撹乱するキナーゼ阻害剤を抽出することができた。その結果、CL3/ZO-1構造の両構造が撹乱を受けるキナーゼ阻害剤(PKC阻害剤を含む9種類)、CL3構造のみが攪乱するキナーゼ阻害剤(1種類)、ZO-1構造のみが撹乱するキナーゼ阻害剤(5種類)を得た。さらに、これらの阻害剤に対し、キナーゼ阻害剤処理濃度、処理時間などを様々に変化させ、共焦点レーザー顕微鏡を用いて細胞接着部分を詳細に観察・検討した結果、細胞-細胞間接着のみに効果を示し、かつ、細胞-基質間接着に影響を与えないキナーゼ阻害剤として、CL3/ZO-1の両構造共に攪乱する阻害剤2種、CL3構造のみ攪乱するもの1種、ZO-1構造のみ攪乱するもの2種を絞り込むことができた。