セミインタクト細胞を用いたVero毒素の輸送・毒性現機構の可視化解析

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Vero毒素(O-157毒素)は細胞のエンドサイトーシス経路によって細胞内に取り込まれ、リソソーム経路を回避しながらゴルジ体へと移行し、さらに分泌経路を遡り小胞体(ER)内へ移行する。そして、小胞体内腔から毒素活性のあるAサブユニットが細胞質へ移行することで毒性を発揮する。その輸送経路・制御機構を明らかにすることは毒性発現の予防や疫学的見地から有用であるばかりか、本来、厳格な選別機構で制御されているはずのエンドサイトーシスとエキソサイトーシス経路の曖昧さと両者のクロスロードを制御する分子機構を明らかにできる。本研究では、細胞膜を一部透過性にしたセミインタクト細胞系と細胞内小胞輸送可視化技術を駆使して、哺乳動物細胞における外来細胞毒素(Vero毒素)の細胞内進入機構とその毒性発現制御機構を明らかにすることを目的とした。本年度までに、Vero毒素をリコンビナントタンパク質として大腸菌により大量調製する系を確立した。生細胞内輸送過程を追跡するためCy2標識したを蛍光標識毒素をプローブとして細胞内輸送過程追跡に用いた。その結果、毒素受容体を持つVero生細胞における蛍光標識毒素の細胞内輸送過程(細胞膜→エンドソーム→ゴルジ体→小胞体)を可視化することに成功した。さらに、後期エンドソーム→TGN間の輸送過程をより詳細に検討する目的で、マンノース6リン酸受容体(cation-dependent)のGFP融合タンパク質(GFP-Man6-P受容体)の細胞内動態の可視化と輸送キネティックスの解析法の樹立した。また、セミインタクトVero細胞を用い、蛍光標識毒素及びGFP-Man6-P受容体の細胞内移行過程の可視化再構成し、毒素及びGFP-Man6-P受容体の後期エンドソーム→ゴルジ体(TGN)間輸送過程を細胞質依存的に再構成することができた。