セミインタクト細胞を用いたVero毒素の輸送・毒性現機構の可視化解析

使用半完整细胞对 Vero 毒素转运和毒性机制进行可视化分析

• 批准号: 16044209
• 负责人: 村田 昌之
• 金额: $ 3.97万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16044209/
• 关键词: ナノバイオ; 感染症; 細菌; 可視化; セミインタクト細胞; 小胞輸送; オルガネラ; エンドサイトーシス; GFP; 小胞体; ゴルジ体; Vero毒素; エキソサイトーシス

Vero毒素(O-157毒素)は細胞のエンドサイトーシス経路によって細胞内に取り込まれ、リソソーム経路を回避しながらゴルジ体へと移行し、さらに分泌経路を遡り小胞体(ER)内へ移行する。そして、小胞体内腔から毒素活性のあるAサブユニットが細胞質へ移行することで毒性を発揮する。その輸送経路・制御機構を明らかにすることは毒性発現の予防や疫学的見地から有用であるばかりか、本来、厳格な選別機構で制御されているはずのエンドサイトーシスとエキソサイトーシス経路の曖昧さと両者のクロスロードを制御する分子機構を明らかにできる。本研究では、細胞膜を一部透過性にしたセミインタクト細胞系と細胞内小胞輸送可視化技術を駆使して、哺乳動物細胞における外来細胞毒素(Vero毒素)の細胞内進入機構とその毒性発現制御機構を明らかにすることを目的とした。本年度までに、Vero毒素をリコンビナントタンパク質として大腸菌により大量調製する系を確立した。生細胞内輸送過程を追跡するためCy2標識したを蛍光標識毒素をプローブとして細胞内輸送過程追跡に用いた。その結果、毒素受容体を持つVero生細胞における蛍光標識毒素の細胞内輸送過程(細胞膜→エンドソーム→ゴルジ体→小胞体)を可視化することに成功した。さらに、後期エンドソーム→TGN間の輸送過程をより詳細に検討する目的で、マンノース6リン酸受容体(cation-dependent)のGFP融合タンパク質(GFP-Man6-P受容体)の細胞内動態の可視化と輸送キネティックスの解析法の樹立した。また、セミインタクトVero細胞を用い、蛍光標識毒素及びGFP-Man6-P受容体の細胞内移行過程の可視化再構成し、毒素及びGFP-Man6-P受容体の後期エンドソーム→ゴルジ体(TGN)間輸送過程を細胞質依存的に再構成することができた。

Verotoxin (O-157 toxin) is a toxin that migrates through cellular pathways, including intracellular pathways, systemic pathways, and secretory pathways. A. Cytoplasmic migration, B. Cytotoxicity, C. Cytotoxicity, D. Cytotoxicity The mechanism of transportation and control is clearly defined, and the mechanism of toxicity development and epidemic prevention is clearly defined. The aim of this study is to clarify the mechanisms for the intracellular entry of foreign cytotoxins (Verotoxins) into mammalian cells and the mechanisms for the prevention of toxicity. This year, Vero toxin production and quality control systems were established. The tracing of intracellular transport processes in human beings can be carried out by using Cy2 markers and light markers. As a result, the toxin receptor was successfully visualized in Vero cells by light marking the intracellular transport process of toxins (cell membrane → cell → microcell). To investigate the transport process between GFP-Man 6-P receptor and GFP-Man 6-P receptor in detail, and to establish an analytical method for visualization and transport of GFP-Man6-P receptor. In Vero cells, light labeling of toxins and visualization of intracellular migration of GFP-Man6-P receptors, cytoplasm-dependent reconstruction of late phase transport of toxins and GFP-Man 6-P receptors (TGN) were performed.

项目成果

EGF signalling amplification induced by dynamic clustering of EGFR

• DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.09.173
• 发表时间: 2004-11-19
• 期刊: BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS
• 影响因子: 3.1
• 作者: Ichinose, J;Murata, M;Sako, Y
• 通讯作者: Sako, Y

セミインタクト細胞アッセイ系の構築

半完整细胞检测系统的构建

• 发表时间: 2004
• 期刊: 実験医学 Vol.20(No.16)
• 作者: Kano;F.;山内忍;村田昌之;Fumi Kano;Fumi Kano;Satomi Nadanaka;加納ふみ
• 通讯作者: 加納ふみ

The maintenance of the ER network is regulated by p47, a cofactor of p97, through phosphorylation by cdc2 kinase

ER 网络的维持由 p47（p97 的辅助因子）通过 cdc2 激酶磷酸化来调节

• 发表时间: 2005
• 期刊: Genes to Cells 10
• 作者: Kano;F.
• 通讯作者: F.

NSF/SNAPs and p97/p47/VCIP135 are sequentially required for cell cycle-dependent reformation of the ER network

• DOI: 10.1111/j.1365-2443.2005.00894.x
• 发表时间: 2005-10-01
• 期刊: GENES TO CELLS
• 影响因子: 2.1
• 作者: Kano, F;Kondo, H;Murata, M
• 通讯作者: Murata, M

セミインタクト細胞アッセイ

半完整细胞测定

• 发表时间: 2005
• 期刊: リボソーム応用の新展開 人工細胞の開発に向けて(秋吉一成, 辻井薫監修)(NTS出版)
• 作者: Kano;F.;山内忍;村田昌之
• 通讯作者: 村田昌之