遺伝子ノックアウトを用いたmiRNAの機能及び生成機構の解析

利用基因敲除分析miRNA功能和产生机制

• 批准号: 15657039
• 负责人: 原田 文夫
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Kanazawa University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15657039/
• 关键词: miRNA; DT40; 遺伝子ノックアウト

昨年度までにトリBリンパ細胞株DT40から得たmiR17-5P(miR91),miR17-3P(miR17),miR18,miR19a, miR20,miR19b, miR92の7種類のmiRNA遺伝子が密集して存在する遺伝子クローンについて、miRNA遺伝子群を含む1.9kbpをpuromycinおよびblasticidin S耐性遺伝子で置き換えたノックアウトコンストラクトを構築し、エレクトロポレーション法によってDT40細胞に順次導入し、それぞれの抗生剤の存在下培養することにより、これらのmiRNA遺伝子を完全に欠失した細胞株を得ることに成功した。変異遺伝子を導入した親株は野性株であることから、この遺伝子群は細胞の増殖には必須でないことが明らかになった。得られたノックアウト細胞株と親株(野性株)とを比較すると、形態的には殆ど変わることはなかった。一方、細胞の増殖速度はノックアウト細胞株で有意に遅くなっていた。各細胞株から全RNAを抽出し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動後、各miRNAに対するプローブを用いてノーザンハイブリダイゼーションを行った。その結果、ノックアウト細胞株ではmiR17-3P及びmiR20の発現が完全に消失していた。しかし、他の5種類のmiRNAの発現は野性株と比較して減少しているものの、完全に消失するまでには至らなかった。これはそれぞれのmiRNAと類似した、あるいは完全に一致した塩基配列を持つmiRNA遺伝子が他に存在することによるものと考えられる。本研究により、2種類のmiRNAの発現が完全に押さえられた細胞株が得られた。この細胞株および野性株で発現しているタンパク質を、二次元マッピングなどで比較することにより、これらのmiRNAのターゲットを特定することができるものと考えられる。

In the past year, seven miRNA genes of miR17 - 5P (miR91), miR17 - 3P (miR17), miR18, miR19a, miR20, miR19b, miR92 were found in cell line DT40. The miRNA gene cluster contains 1.9kbp of puromycin and blasticidin S. The resistant gene cluster is constructed. Dt40 cells were successfully cultured in the presence of antibiotics. The parent plant is introduced into the wild plant, and the parent plant is introduced into the wild plant. A comparison between the parental strain and the morphological strain was made. The growth rate of a cell line is intentionally high. Each cell line is isolated from the whole RNA, and each miRNA is isolated from the whole RNA. As a result, the expression of miR17 - 3P and miR20 in the cell lines disappeared completely. The presence of miRNAs in five other species decreased or disappeared completely. The miRNA sequence is identical to the miRNA sequence. In this study, the expression of miRNAs of two species was completely controlled. This cell line is a wild one, and it's a good idea to compare it with a wild one.