モニター蛍光タンパク質を用いた新規内分泌かく乱作用評価試験の開発

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蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を応用した内分泌かく乱作用評価試験法の確立を行い、種々の化学物質に対してエストロゲン様内分泌かく乱作用を検討し、スクリーニングを行う。FRETを応用した評価試験はレセプターとコアクチベーター間のリガンド依存的なタンパク質間相互作用を検出する方法である。従来のレセプターアッセイとは異なり結合リガンドと遊離リガンドを分離する必要が無く、実験装置を簡略化できることからハイスループット試験法としてより多くの試料の分析に適している。そこで、まず使用するレセプターとコアクチベーターのクローニングを行った。クローニングはPCRによるレセプター(ER□)およびコアクチベーター(SRC1)のリガンド結合部位の増幅およびそれぞれYFPおよびCFPとの融合タンパク質を作製した。しかしながら、計画時に予想していたFRETによる内分泌かく乱作用は検出されなかった。今後、蛍光タンパク質とのスペーサーの長さの検討など必要と判明した。内分泌かく乱物質の代謝産物も網羅的にその内分泌かく乱作用を検討する必要がある。そこで、内分泌かく乱物質の代謝機構として硫酸化に着目し、ヒトおよび魚類(ゼブラフィッシュ)の硫酸転移酵素による内分泌かく乱物質の硫酸化を検討した。その結果、ビスフェノールAなどフェノール構造を持つ内分泌かく乱物質が硫酸化されることが判明した。さらに、ビスフェノールAの塩素及び臭素置換対がより強い内分泌かく乱作用を持つことが明らかとなった。