住血寄生性原虫(トリパノソーマ)を用いた糖鎖構造機能解析モデル系の開発

开发利用裂寄生原生动物（锥虫）分析糖链结构和功能的模型系统

基本信息

批准号：
15658085
负责人：
杉本千尋
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Obihiro University of Agriculture and Veterinary Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

N-結合型糖鎖合成において糖鎖転移に重要な役割を果たす酵素系の一つであるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)遺伝子をTrypanosoma bruceiからクローニングし、その構造解析を行った。同遺伝子は2種類見出され、それぞれOST1,OST2と命名した、N-グリコシレーションに関わるオリゴサッカリルトランスフェラーゼ(OST)遺伝子をクローニングした。すなわち、Leishmania major(L.major)のOST STT3サブユニットの運伝子配列を基にして、プライマーを設計し、PCRにより2種類のOST遺伝子をT.brucei染色体DNAから得た。それらを、TbOST I、TbOST IIと命名し、それぞれ2,430kbp、2,406kbpの遺伝子全長を解析した。予想アミノ酸配列の比較では、他生物の既知OST STT3サブユニットとは高い相向性を示し、ドメイン構造も保存されていることが明らかとなった。それぞれの転写産物のサイズは前者では3.5および4.5kb、後者ではおよそ3.5kbであった。予想アミノ酸配列から設計した合成ペプチドにより作製した免疫血清は原虫の74kDaの蛋白質と皮応した。さらに、TbOSTを2本鎖RNA干渉用のベクターに組み込んで、dsRNAiによる本遺伝子産物の機能解析を試みた。その結果、本遺伝子の発現抑制は致死的であり、TbOSTが原虫の生存に必須の蛋白質をコードしていることを明らかにした。TbOST発現を抑制された原虫細胞質内には濃染する顆粒構造が出現することが米学顕微鏡ならびに電子顕微鏡観察で認められた。これらの出現形質は原虫蛋白質のN-グリコシレーションの阻害とマンノース6燐酸系の阻害の結果と考えられた。また、機能的にもTbOSTは酵母菌OST STT3サブユニットの相当する分子と考えられた。

寡糖胆胆胆管酶（OST）基因是一种从锥虫锥虫中克隆的酶系统之一，在N-连接的聚糖合成中起着重要作用，并分析了结构。发现了两种类型的基因，并且分别将参与N-糖基化的基因（OST）基因分别克隆，称为OST1和OST2。换句话说，底漆是基于利什曼原虫Major（L. major）的OST STT3亚基的换能器序列设计的，并通过PCR从T. brucei染色体DNA获得了两种类型的OST基因。它们被命名为TBOST I和TBOST II，分别分析了2,430 kbp和2,406 kbp的总基因长度。对预测氨基酸序列的比较表明，它们在其他生物体中具有已知的OST STT3亚基表现出高的形态性特性，并且域结构也得到了保守。前者的每个成绩单的大小为3.5和4.5 kb，后者约为3.5 kb。用预测的氨基酸序列设计的合成肽产生的免疫血清与原生动物寄生虫的74 kDa蛋白发生了反应。此外，将tbost纳入载体中以进行双链RNA干扰，并尝试使用dsRNAi对基因产物进行功能分析。结果，揭示了该基因表达的抑制是致命的，而Tbost编码了原生动物存活必不可少的蛋白质。通过美国科学和电子显微镜观察到，染色的颗粒结构出现在原生动物的细胞质中，从而抑制了Tbost表达。这些新兴特征被认为是抑制原生动物蛋白N-糖基化和抑制甘露糖-6-磷酸系统的结果。在功能上，TBOST也被认为是与酵母OST STT3亚基相对应的分子。