トリパノソーマ表面蛋白質に対するラクダ科動物単一鎖抗体作製と構造機能解析への応用

骆驼科锥虫表面蛋白单链抗体的制备及其在结构功能分析中的应用

基本信息

批准号：
07F07183
负责人：
杉本千尋
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

ラクダ、ラマなどラクダ科動物はH鎖一本から成る単一鎖抗体を作り出すことが知られており、この単一鎖抗体のコンパクトな抗原結合部位の構造と高度の熱安定性(100℃の加熱にも安定)という性質を利用して、特に通常の哺乳動物・鳥類抗体が認識し得ない構造に対する抗体が得られる可能性が高い。本計画では、哺乳動物に病原性を有するトリパノソーマの表面たんぱく質に対する単一鎖抗体を作製し、それを利用して蛋白質の構造、機能解析を行うとともに、このような抗体の診断、治療への利用の可能性を模索する。Trypanosoma evansiで免疫したラマ末梢血リンパ球から作製したファージライブラリをT.brucei血流型と昆虫型(プロサイクリック型)の2種類の抗原をコートしたプレート上でパンニングを実施し、抗原と結合するファージを選択的に濃縮し、最終的に抗原と特異的に反応するファージクローンを得た。得られたファージ抗体の反応特異性を酵素抗体法で検討した結果、2種類の抗原と交差反応する抗体であることが判明した。さらに、挿入された一本鎖抗体の遺伝子解析をした結果、抗体定常部分を含む可変部位の配列が確認でき、アライメントの結果では5群に分けられた。次いで、同じファージライブラリーについて、T.evansi抗原を用いて同様のスクリーニングを行い、反応性を有するクローンを得て、抗体遺伝子解析を実施した。上記の様にトリパノソーマを群特異的に検出できる一本鎖抗体を得たことは、人あるいは家畜のトリパノソーマ感染症の診断、治療法開上、貴重な試薬として利用できる。特に、熱に対する安定性を活用し熱帯地方でも長期保存可能な診断試薬として利用できる可能性がある。さらに一本鎖抗体のコンパクトな構造的特性を活かした抗原解析にも利用できる。

已知骆驼，骆驼和其他骆驼会产生由单个H链组成的单链抗体，并且通过利用紧凑型抗原结合位点结构和高热稳定性（在100°C下加热），很有可能抗体对乳腺和乳腺抗体的抗体尤其无法识别。在该项目中，对锥虫的表面蛋白产生了一种单链抗体，该抗体对哺乳动物具有致病性，并使用该蛋白质的结构和功能分析来研究用于诊断和治疗此类抗体的可能性。用evansi免疫的遍地外周血淋巴细胞制备的噬菌体文库被涂在涂有两种类型的抗原的板上：T. brucei血液流动类型和昆虫类型（procyclic型）（procyclic型），并选择性地浓缩了与抗原浓缩的噬菌体，并与phage Clone浓缩，并与phage clone phage Clone一起得到反应。使用酶抗体法检查了获得的噬菌体抗体的反应特异性，发现抗体与两种抗原的抗体交叉反应。此外，对插入的单链抗体的遗传分析表明，确认包含恒定抗体部分的变量位点的序列，并将比对结果分为五组。然后，使用T. evansi抗原以相同的方式筛选了相同的噬菌体文库以获得反应性克隆并进行抗体基因分析。如上所述，获得能够特异性检测的锥虫特异性检测的单链抗体可以用作诊断，治疗人类或牲畜锥虫感染的有价值试剂。特别是，可以利用其热稳定性，并用作诊断试剂，可以在热带地区长时间存储。此外，它可以利用单链抗体的紧凑结构特性来用于抗原分析。