組織の破壊と低形成-細胞間ジャンクションの分子構築破綻と疾患の遺伝的基盤-

组织破坏和发育不全 - 细胞间连接分子结构的破坏和疾病的遗传基础 -

基本信息

批准号：
15658096
负责人：
滝口満喜
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Rakuno Gakuen University (2004)Hokkaido University (2003)
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、上皮や実質組織の破壊や低形成をともなう多彩な動物疾患の臨床知見の集積と分子病態解析の成果から派生したアイディアに基づくものである。本計画は、"細胞間接合の遺伝的異常と疾患"という新しい観点から、従来、遺伝性素因の存在を疑われながら病因のとらえどころがなかった組織破壊を伴う疾患や臓器低形成の分子機構を解明することを将来目標としている。本萌芽研究では、上記仮説実証の第一歩として、タイトジャンクション(TJ)に分布するCL分子ファミリーに焦点を絞り、まず正常組織における分子群の臓器、組織分布を明らかにし、次いで腎、肝、消化管、皮膚の組織破壊、あるいは低形成を呈する臨床例におけるCL分子の異常を検証することを目的とした。クローディン(CL)分子ファミリーは現在までにヒト、マウスでいずれもCL-1〜CL-18までの18分子種が知られている。代表者らは、これまで牛CL-16に関する解析を行ってきたが、本研究計画では小動物(犬と猫)を対象とするため、まずこれら18種のCLを各々同定するためのツールとして特異抗体を作製することから着手した。犬、猫、個々のCL分子にそれぞれ対応する抗体を作製するのは煩雑であり、また交差性が期待されるため、まず犬CLsに対する抗体を作出、必要に応じて抗猫CLs抗体を作製することとした。抗原として用いる各CL分子C末端ペプチド(C末端の細胞質ドメイン30-40アミノ酸残基)を調製するために、各CL分子のcDNAをRACE法で単離し、GST-融合タンパク質ベクターにクローン化した。cDNA単離に利用する臓器、あるいはプライマーはヒトでの知見に基づいた。GST-融合タンパク質として得た各分子から必要なC末端ペプチドを精製し、ウサギに免疫して、アフィニティー精製によって特異抗体を得た。次いで、イムノブロッティング、ならびに正常組織を用いた蛍光抗体法で反応性と特異性を検定した。臨床例を用いた検討では、様々な疾患でCL分子の局在や発現量に変化が認められたが、現時点では疾患特異的に変動する分子の特定には至らず、今後、さらなる解析が必要である。

这项研究基于从各种动物疾病的临床知识的积累中得出的思想，这些临床知识涉及上皮和实质组织的破坏和发育不全以及分子病理分析的结果。从新的“遗传异常和细胞连接疾病”的角度来看，该计划的目的是阐明涉及组织破坏的疾病和器官急症的分子机制，以前怀疑存在遗传倾向，但对病原体的存在很不可思议。作为证明上述假设的第一步，这项研究集中于分布在紧密连接（TJ）中的CL分子家族，首先揭示了正常组织中分子的器官和组织分布，然后在组织破坏性或腹部降低的临床中验证临床情况下的CLLOCULES异常。迄今为止，在人和小鼠中都知道了从Cl-1到Cl-18的18种分子物种。代表以前已经对牛CL-16进行了分析，但是在该研究项目中，这些受试者的焦点是小动物（狗和猫），因此它们首先首先创建了特定的抗体作为识别这18个Cls中的每一种的工具。产生与狗，猫和其他单个CL分子的单个CL分子相对应的抗体很复杂，并且预计将是横截面的，因此首先制备了对狗CL的抗体，并在必要时制备了抗CAT CLS抗体。为了制备用于用作抗原的C末端肽（C末端细胞质结构域30-40氨基酸残基），通过种族方法分离每个Cl分子的cDNA并将其克隆到GST融合蛋白载体中。用于cDNA分离的器官或底漆是基于人类的发现。从每个分子中纯化所需的C末端肽作为GST融合蛋白，并免疫兔子通过亲和力纯化获得特定的抗体。然后，使用正常组织通过免疫印迹和免疫荧光免疫测定法测定反应性和特异性。在临床研究中，已经在各种疾病中观察到了CL分子的定位和表达水平的变化，但是在这一点上，尚未确定在疾病中明确变化的分子，将来需要进一步分析。