構造生物学的アプローチによるタイトジャンクションの透過制御

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本研究は、タイトジャンクション構造基盤を解明し、その透過制御を可能とするモジュレータの創製を目指している。本年度は、構造未解明であるクローディンサブタイプのX線結晶構造解析に向けた実験及びクローディンサブタイプ特異的な結合親和性を高めたC-CPEの改変を進めた。研究開始時に構造未解明であるクローディンサブタイプについて結晶が得られていたため、その結晶性を高める検討を進めた。精製条件及び結晶化条件の最適化を進めてＸ線回折実験を行った結果、5Å程度の回折データが得られた。構造決定にはさらなる改善が必要であるため、結晶性を改善するためにＮ末端リンカーの長さを最小限にしたコンストラクトの検討を行い、良好に発現及び精製であることを確認できた。このコンストラクトについては今後結晶化及びＸ線回折実験を行い、結晶性の改善効果の評価を進め、分解能の改善を目指す。また、研究代表者がこれまでに構造決定したクローディン３とC-CPEの複合体の構造情報を基にして変異体を作製し、タンパク質レベルでのクローディンとC-CPEの相互作用解析を行い、C-CPE改変体の探索を行った。クローディンサブタイプによって特徴的な箇所における相互作用に着目した改変によって、特定のクローディンサブタイプへの結合親和性を高める可能性のあるC-CPEの複数種のアミノ酸変異を見出した。すなわち、クローディンサブタイプ間でアミノ酸残基の側鎖の大きさが異なる箇所に着目し、その箇所におけるC-CPE側のアミノ酸残基を変えることによって、側鎖の大きさに依存した親和性を示す変異を見出すことができた。