MAPKKKのインタラクトームによるストレス受容・認識の分子機構の網羅的解明

利用MAPKKK相互作用组全面阐明应激接收和识别的分子机制

基本信息

批准号：
15659014
负责人：
一條秀憲
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659014/
关键词：
MAPキナーゼキナーゼストレスインタラクトーム

项目摘要

本研究計画は、環境ストレス応答の分子メカニズムの解明を目指し、まずその足掛かりのために、MAPKKKの網羅的なインタラクトーム解析(生体分子間相互作用の組織的解析)を行うものである。本年度は昨年度に引き続き効率的Two-hybridスクリーニング法の開発を行った。我々がこれまでASK1研究で用いてきた酵母Two-hybridシステムを基本として、さらに、使用する酵母種や基本手法などの条件について検討を重ね、より迅速でかつ正確な改良型酵母Two-hybridシステムの構築を行った。その結果、接合を利用したクローンテック社の酵母Two-hybridシステムを改良することにより、様々なキナーゼをベイトとするスクリーニングを同一のプレイライブラリーから同程度のバックグラウンドでスクリーニングすることが可能となった。そこで実際に機能未知の新規MAPキナーゼキナーゼキナーゼASK3の生理機能解明を目的として、腎臓のcDNAライブラリーを用いた酵母Two-hybrid screeningによってASK3結合分子の同定を試み、両者の関係からその生理的役割について検討した。その結果、ASK3結合蛋白質としてWNK4を同定し、ASK3との共発現によりWNK4がリン酸化されること、高浸透圧刺激によりASK3が不活性化され、それに伴いWNK4が脱リン酸化されることを明らかにした。

该研究计划旨在阐明环境压力反应的分子机制，并从垫脚石开始，它将对MAPKKK进行全面的交互分析（对生物分子相互作用的组织分析）。今年，我们继续开发出一种有效的两杂种筛查方法，就像去年一样。基于我们在Ask1研究中使用的酵母两杂交系统，直到现在，我们还研究了诸如所使用的酵母菌物种和基本方法之类的条件，并构建了更快，更准确的改进的酵母两种杂交系统。结果，通过使用共轭改善Clontech的酵母两杂化系统，可以使用各种激酶作为在同一背景中的同一游戏库中筛选筛选。因此，为了阐明新型MAP激酶激酶激酶激酶Ask3的生理功能，实际上是未知的，我们试图通过使用肾脏cDNA文库来鉴定酵母两种杂交筛查的ask3结合分子，并基于两者之间的关系，我们研究了它们的生理作用。结果，WNK4被鉴定为ask3结合蛋白，并揭示了与ask3的共表达会导致WNK4的磷酸化，并且Ask3被过度渗透刺激灭活，导致WNK4的磷酸化。