器官培養コルチ器へのprestin遺伝子(pres)導入-prestinによる蝸牛増幅機構の直接的解析-

将prestin基因(pres)导入Corti器官培养器官 -prestin直接分析耳蜗放大机制-

基本信息

批准号：
15659400
负责人：
欠畑誠治
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hirosaki University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

目的:器官培養コルチ器へのprestin遺伝子(Pres)導入これまでもウイルスベクターを用いた内耳への遺伝子導入は報告されている。しかしウイルスベクターを用いる方法はそれ相応の設備や機器が必要であり、手技の困難さ、実験者の感染といった危険性がある。今回検討した超音波遺伝子導入法は比較的新しい遺伝子導入方法で、手技が簡便であり感染の危険性もない。しかし報告例が少なくまだ確立した手技ではない。方法:1)コルチ器の器官培養:生後4-8日目のマウス(C57BL/6J)の蝸牛を用いて実験した。実体顕微鏡下に蝸牛を摘出し、骨組織、蝸牛軸、血管条を取り外し、頂回転側3分の1と、基底回転側3分の2とに切断し基底回転側を培養組織とした。2)超音波遺伝子導入法によるprestin遺伝子の器官培養コルチ器への導入:マイクロバブルが1:2になるように調製し、ディッシュ上に滴下し、そこに取りだした組織をおき超音波照射した。結果:1)生後4-8日目のマウスから取り出したコルチ器に超音波遺伝子導入法を用いてprestin遺伝子の形質導入をおこなった。培養後48-72時間の時点で蛍光顕微鏡、レーザー顕微鏡にて観察した。GFP遺伝子を挿入することによりGFPの蛍光にてprestin遺伝子の導入を確認した。2)器官培養コルチ器内にGFPの蛍光を認めた。さらにrhodamineにより、有毛細胞を染色したところ、GFPの蛍光は内外有毛細胞の配列に一致していることがわかった。結論:超音波遺伝子導入法によるprestin遺伝子の器官培養コルチ器への導入に成功した。これまでウイルスベクターほどの導入効率が得られていないといった報告があり、今後の検討が必要である。

目的：据报道，使用病毒载体将Prestin基因（PRES）引入器官培养基因转移。但是，使用病毒载体的方法需要适当的设备和设备，这可能会导致实验者的技术和感染风险。这次我们研究的超声基因转移方法是一种相对较新的基因转移方法，该技术很简单，没有感染的风险。但是，报告的情况很少，因此这不是一项公认的技术。方法：1）皮质器官的器官培养：从产后4-8天开始使用小鼠（C57BL/6J）的耳蜗进行实验。将耳蜗在立体显微镜下移除，骨组织，耳蜗轴和纹状体被去除，切成顶端旋转侧的三分之一和基础旋转侧的三分之二，并将基底旋转侧用作培养的组织。 2）使用超声基因转移将prestin基因引入器官培养皮质中：准备将微泡为1：2，滴入盘子上，将其移除的组织和超声辐射。结果：1）使用超声基因转移在出生后4至8天，将Prestin基因转导至从小鼠中去除的Corti机器。孵育后48-72小时，在荧光显微镜或激光显微镜下观察到结果。通过插入GFP基因，通过GFP荧光证实了Prestin基因的引入。 2）在器官培养皮质中观察到GFP荧光。此外，当毛细胞用若丹明染色时，发现GFP的荧光与内部和外毛细胞的序列一致。结论：通过超声基因转移成功地引入了Prestin基因。到目前为止，已经有报道称，病毒载体的引入效率尚未像病毒载体那样有效，并且需要未来的考虑。