破骨細胞におけるシスタチンCの新たな機能(蛋白分解酵素活性抑制以外)はあるか?

半胱氨酸蛋白酶抑制剂C在破骨细胞中是否有任何新功能（除了抑制蛋白酶活性）？

• 批准号: 15659437
• 负责人: 山座 孝義
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 2004
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15659437/
• 关键词: 破骨細胞; シスタチンC; 分化; 骨吸収; c-Fos; NFAT2; TRAF6; RANK; 生存; M-CSF; RANKL

マウス長管骨より骨髄細胞を採取し、macrophage colony stimulating factor(M-CSF)で2日間刺激し、さらにM-CSFおよびreceptor activator of NF-kB ligand(RANKL)で3日間培養し、破骨細胞様細胞を分化させた。培養開始、、培養2日目で、種々の濃度のシスタチンC(CysC)を添加した。培養後total RNAを抽出し、破骨細胞の分化マーカーのmRNA発現をreverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)法で解析した。CysC無添加群と比較して、CysC全期間添加群ならびに前期(培養2日目まで)添加群では、receptor activator of NF-kB(RANK), tartrate-resistant acid phophatase(TRAP), c-FosのmRNA発現に変化は認められなかった。後期(培養2日目以降のみ)添加群では、RANK,TRAP,c-FosのmRNA発現していなかった。後期添加群ではnuclear factor of activated T cells 2(NFAT2)ならびにTNF receptor-associated factor 6(TRAF6)の各mRNA発現していなかった。全期間添加群のNFAT2の発現が減少していたこと、さらに全期間添加群ならびに前期添加群において、TRAf6の発現が上昇していた。象牙質片上で培養した各細胞群を透過型電子顕微鏡で観察した。CysC無添加細胞群では、象牙質片側に刷子縁が発達し、細胞内部に大小の空胞を有する破骨細胞の特徴を備えた細胞が観察された。全期間添加群ならびに前期添加群の細胞では刷子縁の脆弱化が認められた。また、CysC後期添加群の細胞では、刷子縁を具備しておらず、マクロファージ様細胞を呈していた。CysCを後期のみ添加した細胞群を、CysCの刺激が存在しない条件下で、M-CSFおよびRANKLの共刺激下で培養を続けると、TRAP陽性の多核細胞が出現した。この細胞を象牙質片上で培養すると、吸収窩が認められた。以上の結果から、CysC培養後期のみに作用させることで、破骨細胞の分化が阻害される事が判明した、さらに、この分化阻害された細胞をCysCの刺激を除去する事で、可逆的に破骨細胞へ分化することが明らかとなった。現在、マクロファージの表面マーカーを用いて、CysCを作用させた骨髄細胞のcriteriaを検討中である。以上の興味ある研究成果を国際雑誌へ発表するために、英文論文を作成中である。また、研究期間中、関連論文を2編、国際誌に発表した(11.参照)。

从小鼠长骨上收集骨髓细胞，用巨噬细胞刺激因子（M-CSF）刺激2天，然后用M-CSF和NF-KB配体的NF-KB配体（RANKL）的受体激活剂培养3天，以允许骨细胞样细胞区分。在培养的开始时，在培养的第二天添加了各种浓度的半胱氨酸蛋白酶C（CYSC）。培养后，提取总RNA，并通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法分析破骨细胞分化标记的mRNA表达。与无CYSC组相比，在NF-KB的受体激活剂（等级），耐牙龈trate酸性酸性酸性酶（TRAP）或C-FOS mRNA表达中未观察到任何变化。在后期（仅在培养的第二天之后），没有表达等级，陷阱或C-FOS的mRNA表达。后期添加组未表达活化T细胞2（NFAT2）和TNF受体相关因子6（TRAF6）的核因子的mRNA。 NFAT2在整个期间组中的表达降低，并且在整个期间和前任组中TRAF6的表达增加。在透射电子显微镜下观察到在牙本质片上培养的每个细胞组。在无CYSC的细胞中，观察到细胞内有大小液泡的破骨细胞特征的细胞在牙本质的一侧发展。在整个期和早期添加组中，细胞中的刷子边界被削弱。此外，晚期CYSC添加组中的细胞没有刷子边界，并且表现出巨噬细胞样细胞。当在不存在CYSC刺激的条件下，在M-CSF和RANKL下，在CYSC添加的细胞仅在COSSF和RANKL下继续进行较晚阶段时，出现了陷阱阳性的多核细胞。当细胞在牙本质碎片上培养时，观察到吸收窝。从上述结果中可以发现，仅在CYSC培养的后期作用抑制破骨细胞的分化，并且通过去除CYSC的刺激，破骨细胞的分化可逆地分化为破骨细胞。目前，我们正在使用巨噬细胞的表面标记来研究CYSC激活的骨髓细胞的标准。我们目前正在撰写英文论文，以介绍以上有趣的研究结果。此外，在研究期间，在国际期刊上发表了两篇相关论文（见11）。

项目成果

Oxidative Stress-induced DNA Damage in the Synovial Cells of the Temporomandibular Joint in the Rat

• DOI: 10.1177/154405910408300807
• 发表时间: 2004-08
• 期刊: Journal of Dental Research
• 影响因子: 7.6
• 作者: T. Yamaza;K. F. Masuda;I. Atsuta;K. Nishijima;M. Kido;T. Tanaka

Localization of the Endogenous Cysteine Proteinase Inhibitor, Cystatin C, and the Cysteine Proteinase, Cathepsin B, to the Junctional Epithelium in Rat Gingiva

内源性半胱氨酸蛋白酶抑制剂半胱氨酸蛋白酶抑制剂 C 和半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶 B 定位于大鼠牙龈交界上皮

• 期刊: Acta Histochemica et Cytochemica (in press)
• 作者: Yamaza T;Mino S;Atsuta I;Danjo A;Kagiya T;Nishijima K;Zang JQ;Kido MA;Tanaka T.
• 通讯作者: Tanaka T.