硫酸化糖を分子基盤とする抗BSE試薬の開発と異常プリオン抑制機構の解析

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硫酸化ペントサン、ヘパリンなどのグリコサミノグリカンや硫酸多糖体がプリオンの増殖阻害活性を有することは古くから知られている(Ehlers & Diringer, J Gen Virol.,65:1325-1330,1984. Caughey & Raymond, J Virol.,67:643-650,1993.)。これらは、長年にわたり、プリオン病治療法への応用が期待されてきたが、現在まで、硫酸多糖体を使用したプリオン病治療法は確立されていない。天然の硫酸多糖体は硫酸化やアセチル化の部位や割合などが制御されていないため、硫酸多糖体の構造とプリオン増殖阻害活性の構造活性相関の解析が困難である。プリオン増殖阻害活性を担う硫酸化糖の基本骨格が明らかになれば、これをリード化合物として、新たなプリオン病治療薬が創出できる可能性がある。そこで、本研究では、硫酸化部位を正確に制御した合成硫酸化糖を研究代表者の糖鎖モジュール化法を適用することで合成を行い、硫酸化糖の構造とプリオン増殖阻害活性の関係について解析することを目的とした。(1)合成硫酸化糖によるプリオン増殖阻害試験プリオン持続感染細胞I3/I5-9は、10%FBSを含むOpti-MEM(Invitorgen)で培養した。硫酸化糖はMili-Qに溶解して、使用直前に0.45μmのフィルターで濾過滅菌した。硫酸化糖を加え2日間培養した後、PrP^<Sc>検出用の試料を調整した。陽性対象として、プリオン増殖阻害活性を有する硫酸デキストラン500(DS)を使用した。PrP^<Sc>の検出用試料の調整は2-2(5)に述べた通りに行った。また、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットは共同研究者の堀内らの方法に従って実施した。(2)結果・成果硫酸化糖のプリオン増殖阻害活性をPrP^<Sc>の産生量を指標に評価した。8種の合成硫酸化糖のPrP^<Sc>産生阻害活性を比べた。陽性対象であるDS500(DS)は1μg/mlの濃度でも、PrP^<Sc>の産生を70%程度阻害した。調べた硫酸化糖のうち、Hは濃度依存的にPrP^<Sc>産生を阻害した。検量線グラフからPrP^<Sc>量を陰性対照の50%にする50%効果濃度(ED_<50>)は約20μg/mlと推定された。また、硫酸化糖Bも100μg/mlでPrP^<Sc>量が陰性対照の50%以下となり、弱いながらもPrP^<Sc>産生阻害活性を有する可能性が示唆された。