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硫酸化糖を分子基盤とする抗BSE試薬の開発と異常プリオン抑制機構の解析

基于硫酸化糖的抗疯牛病试剂的研制及异常朊病毒抑制机制分析

基本信息

批准号：
16651107
负责人：
西田芳弘
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

硫酸化ペントサン、ヘパリンなどのグリコサミノグリカンや硫酸多糖体がプリオンの増殖阻害活性を有することは古くから知られている(Ehlers & Diringer, J Gen Virol.,65:1325-1330,1984. Caughey & Raymond, J Virol.,67:643-650,1993.)。これらは、長年にわたり、プリオン病治療法への応用が期待されてきたが、現在まで、硫酸多糖体を使用したプリオン病治療法は確立されていない。天然の硫酸多糖体は硫酸化やアセチル化の部位や割合などが制御されていないため、硫酸多糖体の構造とプリオン増殖阻害活性の構造活性相関の解析が困難である。プリオン増殖阻害活性を担う硫酸化糖の基本骨格が明らかになれば、これをリード化合物として、新たなプリオン病治療薬が創出できる可能性がある。そこで、本研究では、硫酸化部位を正確に制御した合成硫酸化糖を研究代表者の糖鎖モジュール化法を適用することで合成を行い、硫酸化糖の構造とプリオン増殖阻害活性の関係について解析することを目的とした。(1)合成硫酸化糖によるプリオン増殖阻害試験プリオン持続感染細胞I3/I5-9は、10%FBSを含むOpti-MEM(Invitorgen)で培養した。硫酸化糖はMili-Qに溶解して、使用直前に0.45μmのフィルターで濾過滅菌した。硫酸化糖を加え2日間培養した後、PrP^<Sc>検出用の試料を調整した。陽性対象として、プリオン増殖阻害活性を有する硫酸デキストラン500(DS)を使用した。PrP^<Sc>の検出用試料の調整は2-2(5)に述べた通りに行った。また、SDS-PAGEおよびウエスタンブロットは共同研究者の堀内らの方法に従って実施した。(2)結果・成果硫酸化糖のプリオン増殖阻害活性をPrP^<Sc>の産生量を指標に評価した。8種の合成硫酸化糖のPrP^<Sc>産生阻害活性を比べた。陽性対象であるDS500(DS)は1μg/mlの濃度でも、PrP^<Sc>の産生を70%程度阻害した。調べた硫酸化糖のうち、Hは濃度依存的にPrP^<Sc>産生を阻害した。検量線グラフからPrP^<Sc>量を陰性対照の50%にする50%効果濃度(ED_<50>)は約20μg/mlと推定された。また、硫酸化糖Bも100μg/mlでPrP^<Sc>量が陰性対照の50%以下となり、弱いながらもPrP^<Sc>産生阻害活性を有する可能性が示唆された。

Sulfated polysaccharides have the ability to inhibit the proliferation of microorganisms (Ehlers & Diringer, J Gen Virol., 65:1325-1330,1984. Caughey & Raymond, J Virol., 67:643-650,1993.)。This is the first time that we've seen the use of sulfated polysaccharides in the treatment of diseases. It is difficult to analyze the relationship between the sulfated and unsulfated parts of natural sulfate polysaccharides and the structure and activity of sulfate polysaccharides. The basic structure of sulfated sugars that contribute to the proliferation inhibitory activity of progesterone is now clear, and it is possible to create new compounds for the treatment of progesterone disease. In this study, the sulfated site was controlled correctly, and the synthesis of sulfated sugar was studied. The sugar chain method was applied to the analysis of the relationship between the synthesis of sulfated sugar and the growth inhibition activity. (1)The growth inhibition test for sulfated sugar synthesis was carried out in the presence of Opti-MEM(Invitorgen), 10% FBS and 10% FBS. Sulfated sugar is dissolved in Mili-Q and sterilized by filtration before use at 0.45μm. Sulfated sugar is added during the day, <Sc>and the sample is adjusted. The positive response is to increase the reproduction inhibition activity of the sulfuric acid by 500(DS). The <Sc>adjustment of PrP^test sample is 2-2(5). SDS-PAGE and other methods used by co-researchers (2)Results: The production of sulfated sugar was evaluated according to the index of growth inhibition activity<Sc>. 8 kinds of synthetic sulfated sugar PrP^<Sc>produce inhibition activity. DS500(DS), the positive counterpart, inhibited PrP production by 70% at a concentration of 1μg/ml<Sc>. To adjust the sulfated sugar, H is a concentration-dependent inhibitor of PrP^production<Sc>. 50% <Sc>of the negative control is estimated to be at a concentration of <50>approximately 20μg/ml (ED_ ). The possibility of PrP^producing inhibitory activity at 100μg/ml of sulfated sugar B was demonstrated when the amount <Sc>of PrP^was below 50% <Sc>of the negative control.