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植物in vitro RNAスプライシング系の開発

植物体外RNA剪接系统的开发

基本信息

批准号：
16657017
负责人：
杉浦昌弘
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16657017/
关键词：
スプライシングタバコ in vitro グループIイントロン葉緑体

项目摘要

1.鋳型遺伝子・前駆体mRNAの検討●in vitro系での転写活性の高いタバコrbcS遺伝子のプロモーター、第1エキソン(207nt)、第1イントロン(93nt)と第2エキソン(120nt)部分を用いたコンストラクトを作製。●更に、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを使用したコンストラクトも作製。●RNAポリメラーゼIIの転写終結は一定でないので、転写物の長さ、3'末端を均一にするため、第2エキソンの直後にアラビドプシスtRNA^<Pro>遺伝子(内部プロモーターを変異させ、自身が転写できないようにしてある)を付加し、得られたrbcS-tRNA^<Pro>転写物を内在するRNasePでtRNAの5'端を切断するアイデアを試みたが、切断活性が弱く、この方法は取りやめた。2.タバコBY2細胞抽出液の検討●はじめに、種々の条件で調製・保存している核in vitro転写液を利用。更に新しい条件でのin vitro用抽出液も調製。3.検出法の検討●^<32>P標識pre-mRNAからのゲル電気泳動によるスプライス産物の直接検出。●RNaseプロテクション・アッセイによるスプライス結合部位の検出。以上、1〜3を組み合わせて種々の反応条件を検討したが、実用的なin vitro系の開発までには至らなかった。4.タバコ葉緑体ゲノムにコードされているロイシンtRNA(UAA)は503ヌクレオチドのグループI型イントロンを持っている。ラン藻にもこのホモログがあり、セルフ・スプライシング活性を示すが、タバコではこの活性がない。各種条件で調製したタバコ葉緑体の抽出液を用いてスプライシング活性を検討したが、活性の検出までには至らなかった。しかし抽出液中に微量含まれるpre-tRNAがスプライスされることを^<32>P-GTPの取り込みで検出できたので、これを手がかりにin vitro系の開発を進めることとした。

1. Analysis of the high level of transcription activity in vitro gene expression system. The first gene expression (207nt), the first gene expression (93nt), and the second gene expression (120nt) were produced using the middle gene expression system.● More information, more information. RNA fragment II is terminated in the middle, the length of the fragment, the uniformity of the 3'end, the addition of the fragment in the middle, the cleavage of the <Pro><Pro>5' end of the RNase P tRNA, and the method of cutting off the activity. 2. The preparation and preservation of BY2 cell extract solution In addition, the new conditions are in vitro prepared with extraction liquid. 3. <32>Detection of pre-mRNA by direct detection of pre-mRNA by electrophoresis.● Identification of RNase binding sites The above, 1 ~ 3 groups are combined to discuss the conditions for the development of the vitro system. 4. UAA (UAA) is a 503-year-old mutant of UAA. The activity of the plant is shown in the table below. Under various conditions, the chloroplast extract was prepared and its activity was investigated. The extract contains trace amounts of pre-tRNA <32>and P-GTP in the development of the nitro system

项目成果

期刊论文数量（14）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

A site-specific factor interacts directly with its cognate RNA editing site in chloroplast transcripts

DOI：
10.1073/pnas.0307163101
发表时间：
2004-01-06
期刊：
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA
影响因子：
11.1
作者：
Miyamoto, T;Obokata, J;Sugiura, M
通讯作者：
Sugiura, M

Comparative analysis of the whole chloro-plast genomes from rice, maize and wheat

水稻、玉米和小麦叶绿体全基因组的比较分析