植物in vitro RNAスプライシング系の開発

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1.鋳型遺伝子・前駆体mRNAの検討●in vitro系での転写活性の高いタバコrbcS遺伝子のプロモーター、第1エキソン(207nt)、第1イントロン(93nt)と第2エキソン(120nt)部分を用いたコンストラクトを作製。●更に、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターを使用したコンストラクトも作製。●RNAポリメラーゼIIの転写終結は一定でないので、転写物の長さ、3'末端を均一にするため、第2エキソンの直後にアラビドプシスtRNA^<Pro>遺伝子(内部プロモーターを変異させ、自身が転写できないようにしてある)を付加し、得られたrbcS-tRNA^<Pro>転写物を内在するRNasePでtRNAの5'端を切断するアイデアを試みたが、切断活性が弱く、この方法は取りやめた。2.タバコBY2細胞抽出液の検討●はじめに、種々の条件で調製・保存している核in vitro転写液を利用。更に新しい条件でのin vitro用抽出液も調製。3.検出法の検討●^<32>P標識pre-mRNAからのゲル電気泳動によるスプライス産物の直接検出。●RNaseプロテクション・アッセイによるスプライス結合部位の検出。以上、1〜3を組み合わせて種々の反応条件を検討したが、実用的なin vitro系の開発までには至らなかった。4.タバコ葉緑体ゲノムにコードされているロイシンtRNA(UAA)は503ヌクレオチドのグループI型イントロンを持っている。ラン藻にもこのホモログがあり、セルフ・スプライシング活性を示すが、タバコではこの活性がない。各種条件で調製したタバコ葉緑体の抽出液を用いてスプライシング活性を検討したが、活性の検出までには至らなかった。しかし抽出液中に微量含まれるpre-tRNAがスプライスされることを^<32>P-GTPの取り込みで検出できたので、これを手がかりにin vitro系の開発を進めることとした。