アーキアにおけるRNA末端形成システムの解明

古细菌 RNA 末端形成系统的阐明

基本信息

批准号：
16658033
负责人：
小林達彦
金额：
$ 2.3万
依托单位：
University of Tsukuba
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

ポリA付加酵素(poly(A) polymerase : PASPめて有力な候補として発見した2つの遺伝子(ORF1、ORF2)の内、前年度精製に成功したORF2について、12-merのDNAオリゴ(oligo(dA)12)の5'末端を32Pで標識したものを基質として使用し、PAP活性測定を行った。温度・塩濃度・反応時間など様々な条件を検討したが顕著なPAP活性を確認することが出来なかった。ORF1をコードする遺伝子に関しては、プライマーを設計し、T7プロモーター支配下に接続した発現プラスミドを構築した。大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILを宿主として大量発現を試みた。前培養(アンピシリン50μg/ml、クロラムフェニコール30μg/ml)後、新たに2YT培地に植菌(1%)し、37℃で培養した。OD660=0.4で、誘導剤であるIPTGを終濃度1mMになるように加え、その後28℃で4時間培養した。集菌した菌体を超音波破砕し、遠心して調製した無細胞抽出液をHiTrapCMに供することで、SDS-PAGE上でほぼ単一バンドになるまで(可溶性タンパク質として)精製することに成功した。PAPと同様、立体構造的にnucleotidyltransferase superfamilyに属し、tRNAの3'末端形成システムに関与するCCA付加酵素についても、P.horikoshii OT3株からアーキアのCCA付加酵素と相同性のある遺伝子を1つ発見した。この遺伝子のプライマーを設計し、lacプロモーターあるいはT7プロモーター支配下に接続した発現プラスミドを構築し、大腸菌での大量発現条件の検討を行った。

聚（a）聚合酶：在两个基因（ORF1和ORF2）中，它们被发现为PASP的潜在候选，ORF2（成功纯化了上一年），使用具有12-Mer DNA Oligo（Oligo（da）12）标记为32p的底物的底物测量PAP活性。检查了各种条件，例如温度，盐浓度和反应时间，但未确认PAP活性。对于编码ORF1的基因，设计了引物，并构建了连接到T7启动子的表达质粒。大肠杆菌BL21-Codonplus（DE3）-RIL用作宿主。尝试大量表达。培养前（氨苄青霉素50μg/ml，氯霉素30μg/ml），并在2yt培养基（1％）中接种，并在37°C下培养。在OD660 = 0.4时，将诱导剂IPTG添加到最终浓度为1 mm，然后在28°C培养4小时。对收集的细胞进行超声破坏并离心，以制备无细胞提取物，以纯化为SDS-PAGE上的几乎单个带。与PAP一样，将核苷酸转移酶在三维结构中构成。在Horikoshii的P. horikoshii OT3菌株中，还发现了属于超家族并参与TRNA的3'端形成系统的CCA添加酶。设计了该基因的引物，并构建了与LAC启动子或T7启动子控制的表达质粒，并检查了大肠杆菌中大型表达的条件。