アーキアにおけるRNA末端形成システムの解明

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ポリA付加酵素(poly(A) polymerase : PASPめて有力な候補として発見した2つの遺伝子(ORF1、ORF2)の内、前年度精製に成功したORF2について、12-merのDNAオリゴ(oligo(dA)12)の5'末端を32Pで標識したものを基質として使用し、PAP活性測定を行った。温度・塩濃度・反応時間など様々な条件を検討したが顕著なPAP活性を確認することが出来なかった。ORF1をコードする遺伝子に関しては、プライマーを設計し、T7プロモーター支配下に接続した発現プラスミドを構築した。大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILを宿主として大量発現を試みた。前培養(アンピシリン50μg/ml、クロラムフェニコール30μg/ml)後、新たに2YT培地に植菌(1%)し、37℃で培養した。OD660=0.4で、誘導剤であるIPTGを終濃度1mMになるように加え、その後28℃で4時間培養した。集菌した菌体を超音波破砕し、遠心して調製した無細胞抽出液をHiTrapCMに供することで、SDS-PAGE上でほぼ単一バンドになるまで(可溶性タンパク質として)精製することに成功した。PAPと同様、立体構造的にnucleotidyltransferase superfamilyに属し、tRNAの3'末端形成システムに関与するCCA付加酵素についても、P.horikoshii OT3株からアーキアのCCA付加酵素と相同性のある遺伝子を1つ発見した。この遺伝子のプライマーを設計し、lacプロモーターあるいはT7プロモーター支配下に接続した発現プラスミドを構築し、大腸菌での大量発現条件の検討を行った。