アーキアにおけるRNA末端形成システムの解明

古细菌 RNA 末端形成系统的阐明

• 批准号: 16658033
• 负责人: 小林 達彦
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: University of Tsukuba
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16658033/
• 关键词: アーキア; RNA末端形成システム; ポリA付加酵素; CCA付加酵素; 大量発現; 精製

ポリA付加酵素(poly(A) polymerase : PASPめて有力な候補として発見した2つの遺伝子(ORF1、ORF2)の内、前年度精製に成功したORF2について、12-merのDNAオリゴ(oligo(dA)12)の5'末端を32Pで標識したものを基質として使用し、PAP活性測定を行った。温度・塩濃度・反応時間など様々な条件を検討したが顕著なPAP活性を確認することが出来なかった。ORF1をコードする遺伝子に関しては、プライマーを設計し、T7プロモーター支配下に接続した発現プラスミドを構築した。大腸菌BL21-CodonPlus(DE3)-RILを宿主として大量発現を試みた。前培養(アンピシリン50μg/ml、クロラムフェニコール30μg/ml)後、新たに2YT培地に植菌(1%)し、37℃で培養した。OD660=0.4で、誘導剤であるIPTGを終濃度1mMになるように加え、その後28℃で4時間培養した。集菌した菌体を超音波破砕し、遠心して調製した無細胞抽出液をHiTrapCMに供することで、SDS-PAGE上でほぼ単一バンドになるまで(可溶性タンパク質として)精製することに成功した。PAPと同様、立体構造的にnucleotidyltransferase superfamilyに属し、tRNAの3'末端形成システムに関与するCCA付加酵素についても、P.horikoshii OT3株からアーキアのCCA付加酵素と相同性のある遺伝子を1つ発見した。この遺伝子のプライマーを設計し、lacプロモーターあるいはT7プロモーター支配下に接続した発現プラスミドを構築し、大腸菌での大量発現条件の検討を行った。

Poly(A) polymerase : PASP, A potent candidate, was successfully purified from ORF1 and ORF2 in the previous year, and the 5'terminal of 12-mer DNA was successfully identified by 32P in oligo(dA)12. PAP activity was measured. Temperature, concentration, reaction time, etc. are the conditions for determining PAP activity. ORF1: The first generation of the second generation of the first generation of the second generation of the first generation of the first generation of the second generation of the first generation of the first generation of the first E. coli BL21-CodonPlus(DE3)-RIL hosts were found in large quantities. After pre-culture (50μg/ml, 30μg/ml), new culture (1%), culture at 37℃. OD660 =0.4, IPTG final concentration 1mM, incubation at 28℃ for 4 days Collection of bacteria, cell disruption, telecentric preparation, cell-free extract, purification, SDS-PAGE, and purification were successful. PAP and 3-dimensional structure of the nucleotidyltransferase superfamily, tRNA 3'terminal formation of the system related to the CCA enzyme, P. horikoshii OT3 strains lost their identity to CCA enzyme. This paper discusses the design and development of the bacteria under the control of T7.