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予定外胚葉領域由来全能性幹(ES)細胞からの歯牙の誘導とその組織再生医療への応用

预期外胚层区域的全能干细胞诱导牙齿及其在组织再生医学中的应用

基本信息

批准号：
16659551
负责人：
岡本哲治
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

アフリカツメガエル胚未分化細胞再集合培養系を用いて以下の検討を行った.アニマルキャップ(AC)をCa^<2+>,Mg^<2+>を含まないSteinberg's solution(SS)中で細胞解離後,activin A(25ng/ml)1時間処理細胞群と未処理群を種々の比率で混合し,Ca^<2+>,Mg^<2+>を含むSS中で再集合体を形成し培養後,組織学的解析、RT-PCR法,in situ hybridization法にて各種遺伝子発現を検討した.また,再集合体を正常胚へ移植し,組織学的ならびに分子生物学的に解析した.1.Activin A処理群:未処理群1:5から形成した再集合体(1:5再集合体)は,培養期間7日では,組織学的に主に軟骨組織から構成され,顎顔面領域ならびに軟骨に発現する遺伝子群の発現を認めた.ISH法の結果,培養期間4日目において,gsc,X-dll4,Sox9,Col2の遺伝子発現の局在を認めた.しかし,Hoxb9の発現は認めなかった.2.1:5再集合体を正常胚(st23)下顎相当部へ移植を行うと,10日目組織は軟骨組織によって構成され,1,4日目移植組織でgsc,X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2の発現をを認めた.3.1:5再集合体の正常胚(st23)腹部への移植では,10日目組織には,軟骨組織,筋組織,神経組織,眼球様構造、歯胚様構造を認めgsc,X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2発現,歯胚様構造部にはアメロジェニン陽性を認めた.以上の結果再集合培養系を用いてin vitroで未分化細胞から細胞分化と位置情報をコントロールすることができた.次にアフリカツメガエルの結果に基づき,マウスES細胞を用いて以下の検討を行った。方法:フィーダー細胞を用いずLIFを含む無血清ES7培地を用いて未分化性を維持したマウスES-D3細胞を,中胚葉組織誘導能を持つ因子で処理、あるいは腹側化因子で処理を行い、それぞれ胚葉体(embryoid body, EB)を形成させた。続いて、これらEBを再集合させ、さらに培養を行った後、EBを組織学的ならびにRT-PCR法を用いて解析した。結果:4週間培養後の再集合体には、アルシアンブルーならびにII型collagen陽性の軟骨組織を認めた。また、頭部に発現するOTX-2ならびにneural crest形成に関与するAP-2の発現を認めたことから,この再集合体は頭部の位置情報を持つことが明らかとなった。以上のことから、本培養系は,種々の器官発生メカニズムの解明ならびに今後の再生医療に向け、有用なモデルとして発展できると考えられる。

The reassembly culture system of undifferentiated embryo cells was studied by using the following methods. After cell dissociation in Steinberg's solution(SS),activin A(25ng/ml) was added to the mixture of 1 time-treated cell population and untreated cell population. After culture, the re-aggregates were formed. Histological analysis, RT-PCR and in situ hybridization were performed. 1. Activin A treatment group: untreated group 1:5 formed reassembly (1:5 reassembly), but 7 days after culture, histological main cartilage tissue composition was observed, jaw area and cartilage development was observed.ISH method results showed that 4 days after culture, the development of gene was observed,gsc,X-dll4,Sox9, Col2. The development of Hoxb9 in normal embryo (st23) was identified at 2.1:5. The development of cartilage tissue in 10-day-old tissue was identified at 1,4-days.3.1:5 The development of gsc,X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2 in normal embryo (st23) was identified at 10-days.3.1:5 The development of cartilage tissue, tendon tissue, nerve tissue, eyeball structure, dental embryo structure was identified at 1,4-days.3.1:5. The results of the above re-aggregation culture system were used in vitro to identify undifferentiated cells, cell differentiation and position information. The results of this study are as follows: Methods: The cells were cultured with LIF containing serum-free ES7 cells, and the embryonic body (EB) was formed by the induction of mesodermal tissue. Eb reassembly, culture and analysis by RT-PCR Results: After 4 weeks of culture, the reassembly was identified as type II collagen positive cartilage tissue. OTX-2 and neural crest formation are related to AP-2 and AP-2 formation, and the position information of the head of the reassembly is maintained. This culture system is suitable for the development of regenerative medicine in the future.