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予定外胚葉領域由来全能性幹(ES)細胞からの歯牙の誘導とその組織再生医療への応用

预期外胚层区域的全能干细胞诱导牙齿及其在组织再生医学中的应用

基本信息

批准号：
16659551
负责人：
岡本哲治
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至 2005
项目状态：
已结题

项目摘要

アフリカツメガエル胚未分化細胞再集合培養系を用いて以下の検討を行った.アニマルキャップ(AC)をCa^<2+>,Mg^<2+>を含まないSteinberg's solution(SS)中で細胞解離後,activin A(25ng/ml)1時間処理細胞群と未処理群を種々の比率で混合し,Ca^<2+>,Mg^<2+>を含むSS中で再集合体を形成し培養後,組織学的解析、RT-PCR法,in situ hybridization法にて各種遺伝子発現を検討した.また,再集合体を正常胚へ移植し,組織学的ならびに分子生物学的に解析した.1.Activin A処理群:未処理群1:5から形成した再集合体(1:5再集合体)は,培養期間7日では,組織学的に主に軟骨組織から構成され,顎顔面領域ならびに軟骨に発現する遺伝子群の発現を認めた.ISH法の結果,培養期間4日目において,gsc,X-dll4,Sox9,Col2の遺伝子発現の局在を認めた.しかし,Hoxb9の発現は認めなかった.2.1:5再集合体を正常胚(st23)下顎相当部へ移植を行うと,10日目組織は軟骨組織によって構成され,1,4日目移植組織でgsc,X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2の発現をを認めた.3.1:5再集合体の正常胚(st23)腹部への移植では,10日目組織には,軟骨組織,筋組織,神経組織,眼球様構造、歯胚様構造を認めgsc,X-Hoxa2,X-dll4,Sox9,Col2発現,歯胚様構造部にはアメロジェニン陽性を認めた.以上の結果再集合培養系を用いてin vitroで未分化細胞から細胞分化と位置情報をコントロールすることができた.次にアフリカツメガエルの結果に基づき,マウスES細胞を用いて以下の検討を行った。方法:フィーダー細胞を用いずLIFを含む無血清ES7培地を用いて未分化性を維持したマウスES-D3細胞を,中胚葉組織誘導能を持つ因子で処理、あるいは腹側化因子で処理を行い、それぞれ胚葉体(embryoid body, EB)を形成させた。続いて、これらEBを再集合させ、さらに培養を行った後、EBを組織学的ならびにRT-PCR法を用いて解析した。結果:4週間培養後の再集合体には、アルシアンブルーならびにII型collagen陽性の軟骨組織を認めた。また、頭部に発現するOTX-2ならびにneural crest形成に関与するAP-2の発現を認めたことから,この再集合体は頭部の位置情報を持つことが明らかとなった。以上のことから、本培養系は,種々の器官発生メカニズムの解明ならびに今後の再生医療に向け、有用なモデルとして発展できると考えられる。

アフリカツメガエル embryos undifferentiated cells to set training department を using いて following の検 line for をった. アニマルキャップ (AC) を Ca ^ > < 2 +, Mg ^ 2 + < > を containing まない Steinberg 's solution (SS) で cells after dissociation, activin A(25ng/ml)1 time treated cell population と untreated population を species 々 <s:1> ratio で mixed と,Ca^<2+>,Mg^<2+>を containing むSS で reaggregates を after forming a <s:1> culture, histological analysis, RT-PCR method,in situ Hybridization method にて various legacy 伝発を now son beg し検た. また, then aggregate をしへ normal embryo transplantation, histological ならびに molecular biology に parsing した. 1. Activin A 処 manage group: not 処 principle of 1:5 から form した aggregation (1:5 then aggregate) は again, training during the 7th では, histological に main に cartilage から constitute され, jaw facial areas ならびに cartilage に発 now する heritage 伝 subgroup の発を now recognize めた. の ISH method as A result, the training during the 4th item において, GSC, X-ray dll4, S Ox9, Col2 の posthumous son 伝発 now の bureau in を recognize めた. しかし, Hoxb9 の発は now recognize めなかった. 2.1:5 to aggregate を gege (st23) jaw line をう quite department へ transplantation と, 10 orders は cartilage tissue によって constitute され, 1, 4, eye transplant tissue で GSC, X-ray Hoxa2, X-ray dl L4, Sox9, Col2 の発 now をを recognize めた. 3.1:5 to aggregate の gege (st23) abdomen への transplantation では, 10 organised には, cartilage, muscle tissue, god 経 organization, eyeball others in structure, 歯 embryo others を recognize め GSC, X-ray Hoxa2, X-ray dll4, Sox9, Col2 発, 歯 embryo to others The structural department is ににアメロジェニアメロジェニを positive を confirmed めた. Above の results to set training department をいて in vitro で undifferentiated cells から cell differentiation と location intelligence をコントロールすることができた. Time にアフリカツメガエルの results にづき, マウスを ES cells with いて following の検 line for をった. Methods: フィーダー cells を using いず LIF を containing む serum-free ES7 petty を with いて undifferentiated sex を maintain したマウスを ES - D3 cells, mesoderm groups can induce を hold つ factor で処, あるいは ventral change factor で処を line い, それぞれ germ layer body (embryoid body, EB) を form させた. 続いて, これら EB を re-collect させ, さらに line cultivate をった, EB を histological ならびにを rt-pcr method with いて parsing した. Results: 4 weeks after incubation の collection again には, アルシアンブルーならびに type II collagen positive の cartilage を recognize めた. また, head に発 now する working - 2 ならびに neural crest formation に masato and する AP - 2 の発を now recognize めたことから, この aggregation はの head position information を again hold つことが Ming らかとなった. Above のことから, this training is は, kind of 々の organ 発 raw メカニズムの interpret ならびにの regeneration in the future medical にけ, useful なモデルとして発 exhibition できると exam えられる.