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無血清再集合培養法を用いたマウスES細胞及びヒト骨髄幹細胞からの顎骨・歯胚誘導

采用无血清再增殖培养法诱导小鼠 ES 细胞和人骨髓干细胞诱导颌骨和牙胚

基本信息

批准号：
20659316
负责人：
岡本哲治
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

再生医療の手段として,近年ヒト胚性幹(ES)細胞や人工多能性(iPS)細胞が注目されている。しかしながら,ES, iPS細胞の増殖・分化制御については,フィーダー細胞や血清添加培地や成分が非公開の添加因子など,様々な培養条件で検討されている為,比較検討が非常に困難である。我々は,この様な問題を解決する為,フィーダー細胞無しで,マウスiPS(miPS)細胞の増殖・分化能を維持可能な無血清培養条件の確立を目指した。理化学研究所バイオリソースセンターcell bankより提供をうけた,胚線維芽細胞由来miPS細胞を用い,フィーダー細胞を用いない無血清培養条件を検討した。未分化マーカーとして,Oct3/4, Nanog遺伝子発現と,アルカリフォスタファーゼ活性について検討した。また,ラミニン処理プレート上で,FGF-2を添加しmiPSの分化能を検討した結果、我々が開発したマウスES細胞用無血清培地ESF7をもとに,マウスiPS細胞の未分化性を継代・維持可能な無血清培養系を確立できた。この培養条件で培養したマウスiPS細胞は未分化マーカーであるOct3/4, Nanogを発現していた。また,miPS細胞はラミニン処理とFGF-2を添加で、形態的に神経細胞特有の突起を形成した。これらの結果から、miPS細胞の増殖能と未分化性を維持可能な無血清培養系を確立したと考える。上記で決定した無血清培養条件下に,miPS細胞に、nodal, BMP-2, -4, -7, FGF-1, -2, -7, -10を添加し、スミロン・スフェロイドプレートに播種してスフェロイドを形成させ、10日間培養を行い、4%パラフォルムアルデヒドで固定、あるいは、RNAを抽出し、組織学的検討及びDNAマイクロアレイ解析を行った結果、nodal、およびBMP-4により顎顔面の位置情報を示す遺伝子発現を認めた。未分化な骨髄幹細胞をnodal、あるいはBMP 4,で処理した細胞群を混合し、スミロン・スフェロイドプレートに播種してスフェロイドを形成させ、10日間培養を行い、組織学的検討およびRNAを抽出した。4%パラフォルムアルデヒドで固定したスフェロイドのパラフィン切片を作製し、組織学染色(HE染色、アルシアンブルー・PAS二重染色、アニザリンレッド染色)を行い、誘導される組織を解析した。その結果、アルシアンブルー・PAS二重染色、アニザリンレッド陽性の組織の誘導を認めた。以上の結果から、我々の開発した無血清培地ESF10培地を用いることによりマウスES細胞のみならず、miPS細胞やヒト間葉系幹細胞を長期間未分化性を維持して培養できることが明らかとなり、臨床応用への可能性が強く期待される。

In recent years, embryonic stem (ES) cells and artificial pluripotent (iPS) cells have attracted much attention as a means of regenerative medicine. For ES, iPS cell proliferation and differentiation control, cell culture and serum addition are very difficult to compare. We aim to solve this problem by establishing serum-free culture conditions for cell proliferation and differentiation. Institute of Physical Chemistry, Inc., Serum-free culture conditions for embryonic germ cell origin Undifferentiated,Oct3/4, Nanog gene development, undifferentiated, undifferentiated activity In addition,FGF-2 was added to the culture medium to investigate the differentiation ability of miPS cells. The results showed that the development of ES cells in serum-free culture medium ESF7 was successful, and the undifferentiation ability of iPS cells was maintained. The culture conditions are as follows: undifferentiated iPS cells, Oct. 3/4, Nanog cells MiPS cells were treated with FGF-2 and morphologically modified to form neuron-specific projections. The results show that miPS cells can proliferate and maintain undifferentiated cells, and serum-free culture lines can be established. In the serum-free culture conditions determined above,miPS cells, nodal, BMP-2, -4, -7, FGF-1, -2, -7, -10 were added, seeded, and cultured for 10 days. 4% of miPS cells were immobilized. RNA was extracted. Histological analysis and DNA analysis were performed. Nodal, BMP-4, and facial position information are displayed. Undifferentiated bone marrow stem cells were cultured in nodal, BMP 4, mixed with cell populations, seeded, and RNA extracted in 10-day culture. 4% of the cells were fixed and stained histologically (HE staining, PAS double staining, ALP staining). The results were as follows: PAS double staining, induction of positive tissues. These results suggest that the development of ESF10 in serum-free culture is highly likely to result in long-term maintenance of undifferentiated ES cells, miPS cells and mesenchymal stem cells in culture.