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予定外胚葉領域由来全能性幹(ES)細胞からの歯牙の誘導とその組織再生医療への応用

预期外胚层区域的全能干细胞诱导牙齿及其在组织再生医学中的应用

基本信息

批准号：
13877341
负责人：
岡本哲治
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2001
资助国家：
日本
起止时间：
2001 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

アクチビンAは,TGF-βfamilyに属しアフリカツメガエル(Xenopus)において中胚葉誘導能を示すことが報告されて以来,代表的な分化誘導因子として認識されている。我々は,in vitroにおいてXenopus胞胚期予定外胚葉片(アニマルキャップ)をアクチビンA存在下で培養(アニマルキャップアッセイ;ACA)すると濃度依存的に血球,筋肉,脊索や心臓,膵臓などの中胚葉組織が誘導されること,また,アクチビンAにて定時間前処理したアニマルキャップを,アクチビンA未処理のアニマルキャップ二枚で挟み込むSandwich culture(SC)では,アクチビンAの前処理時間に依存して,頭部から胴尾部の組織が誘導されることをすでに報告した。また,ACA-SCによりアルシアンブルー陽性軟骨様原基が誘導されることを報告した。今回我々は,ACA-SCにより誘導されたアルシアンブルー陽性軟骨様原基をRT-PCR, insitu hybridization(ISH),免疫組織染色を用いてさらに検討した。[方法]ACA-SCをそれぞれ2,4,7,10,14日間行ったexplant組織からRNAを抽出し,type 1 collagen(coll 1),type2 collagen(coll 2),Xenopus Distal-less4(Xdll 4),cartilage homeo-protein 1(car 1)の発現をRT-PCRにて検討した。また,Nieuwkoop and Faber Stage(St.)22〜28,36,41のXenopus embryoを頭部,胴尾部に切断後,RNAを抽出し上記遺伝子の発現をRT-PCRにて検討した。さらに,4,7,10日間培養したexplantのcoll 2,car 1の局在をISHにて,また,coll 2の局在を免疫組織染色にて検討しXenopus embryoの各Stageと比較した。[結果と考察]coll 1,2は2〜14日間培養したexlpantにおいて発現を認めた。embryoでは,St.22〜28以降に強く発現していた。Xdll 4は,explantでは2〜14日間培養したもので発現を認め,embryoではSt.22〜28以降の頭部のみで発現を認めた。car 1は,explantでは,その発現は2,3日間培養したもので弱く,4〜10日間培養したもので強く発現していた。embryoでは,St.22〜28の頭部で弱い発現を認めSt.36,41において強く発現していた。またISHにおいては,coll 2,car 1ともに4,7日間培養したexplantの軟骨原基に限局して発現を認めたが,10日間では発現が消失した。さらに,免疫組織染色において,4,7,10日間培養したexplantの軟骨原基におけるcoll 2の発現は,それぞれSt.40,42,44の鰓弓軟骨におけるcoll 2の発現に類似した像を示した。以上の結果から,in vitroにおいて予定外胚葉領域未分化細胞からアニマルキャップアッセイにより誘導された軟骨組織は頭部軟骨組織である可能性が強く考えられた。

Xenopus Since the report of いて mesoderm induction ability by すことがされて, the representative な differentiation induction factor として has been recognized by されている. I am 々は,in In vitroにおいてXenopus embryo stage predetermined ectoembryonic leaves (アニマルキャップ)をアクチビンA Cultivation in the presence of (ACA) can produce concentration-dependent blood cells, muscles, and notochords. Heart 蓓, 膵臓などのMesodermal tissue が induction されること, また, アクチビンAにて fixed time pre-treatment したアSandwich culture(SC)では,アクチビンAのpre-processing timeにdependsして,headから胴のorganismがinducingされることをすでにreportした.また, ACA-SC によりアルシアンブルーpositive cartilage primordium が induction されることを report した. This time I will use RT-PCR, insitu hybridization (ISH), and immune tissue staining of ACA-SC induced cartilage-positive cartilage primordium. [Method] ACA-SCをそれぞれ2,4,7,10,14 days, explant tissue, RNA extraction, type 1 collagen (coll 1), type2 collagen (coll 2), Xenopus Distal-less4 (Xdll 4), cartilage homeo-protein 1 (car 1) This is a RT-PCR test. After cutting off the head and tail of the Xenopus embryo at Nieuwkoop and Faber Stage (St.) 22~28, 36, and 41, the RNA was extracted and the RT-PCR was performed.さらに, 4, 7, 10 days of culture, した explant の coll 2, car 1 の Bureau in ISH にて, また, coll 2 bureau in を immune tissue staining にて検 Discussion し Xenopus embryo の Each stage and comparison した. [Results and investigation] coll 1,2 and 2 to 14 days of culture and exlpant are now recognized. Embryo, St. 22~28, に强く発appears, していた. Xdll 4 は, transplant では 2 to 14 days of culture したもの発见を cognition め, embryo では St. 22 ～ 28 and then drop のみで発见を cognizance め. car 1 は, transplant では, その発appear は 2, 3 days of culture したもので weak く, 4~10 days of culture したものでstrong く発appears していた. Embryonic では, St. 22~28 で weak い発 appear を recognized め St. 36, 41 において strong く発见していた.またISHにおいては,coll 2,car 1ともに4,7 days culture したexplantのcartilage primordium にlimitation して発appearsをcognitionめたが,10 days では発appears がdisappear した.さらに, immune tissue staining において, 4,7,10 days of culture したexplantのcartilage primordium におけるcoll 2の発appearsは,それぞれSt.40,42,44のbranchial arch cartilageにおけるcoll 2の発appearsにsimilar to した resembles をshows した. The above result is the result of Undifferentiated cells in the ectodermal area determined in vitro The cartilage tissue of the head is induced by the cartilage tissue of the head.