標識されていない神経細胞のin vivo可視化パッチクランプ法の開発と応用

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生きた状態の丸ごとの動物の脳において活動中の神経細胞からホールセル記録をとるための新しい方法の開発を行う。この方法では、細胞外領域に蛍光色素を導入し、2光子励起顕微鏡で脳内の神経細胞を"影"として可視化する。脳内の細胞外領域への蛍光色素の導入方法としては、パッチクランプ電極の内液に蛍光色素を含めておき、僅かな陽圧を電極にかけるだけで良く、細胞の蛍光標識や蛍光色素を前もって注入するなどの前処理を一切必要としない、非常に簡便な方法である。可視化された細胞に記録電極を近づけることで、目的の細胞からホールセル記録を行うことを可能にした。前年度までに、麻酔下のマウス大脳および小脳において目的の細胞を可視化してホールセル記録を行う方法の最適化を行い、大脳新皮質および小脳皮質の投射ニューロンや小型の介在ニューロンの細胞体や樹状突起から高い成功率でホールセル記録を行うことを可能にし、また、電気穿孔によって脳内の単一ニューロンへ蛍光色素やプラスミドDNAを導入することにも成功した。今年度は、この電気穿孔法の効率を向上させるため、与える電圧パルスの条件などを最適化し、70%以上の導入効率を達成した。また、GFPを電気穿孔で導入したニューロンの形態を数週間から1ケ月の長期にわたって観察することが可能であることを示した。