シェーグレン症候群患者の自己抗体を用いた組織障害蛋白遺伝子のクローニング

使用干燥综合征患者的自身抗体克隆组织损伤蛋白基因

• 批准号: 18659610
• 负责人: 上松 隆司
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Matsumoto Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18659610/
• 关键词: シェーグレン症候群; 自己抗体; 遺伝子; クローニング; 遺伝子クローニング

シェーグレン症候群におけるリンパ球の浸潤・増殖やγグロブリン産生機構のほか、唾液腺導管上皮の萎縮や破壊を誘導する自己抗体とその抗原(組織障害抗原蛋白)の由来は明らかにされていない。シェーグレン症候群の病態を克服するためには、治療の分子標的となる組織障害抗原蛋白とその抗原提示機序を明らかにすることが必須である。そこで、治療分子標的となりうる唾液腺組織障害抗原蛋白を明らかにすることを目的とし、1、シェーグレン患者の自己抗体の精製、2、自己抗体が認識している組織障害蛋白の唾液腺組織内での局在を検討した。まず、患者血清を用いてProtein-Aビーズでγ-グロブリンを結合させ、その後エルーションを行ってγ-グロブリンを精製した。これらの免疫グロブリンは、少量ずつ分注して使用するまで-25度に保存した。免疫組織染色を行うために、正常唾液腺(顎下腺、口唇腺等)とシェーグレン症候群患者の口唇腺を凍結またはパラフィン包埋し、厚さ6μmの連続切片をクライオスタットまたはミクロトームにて作製した。一次抗体としてシェーグレン患者抗血清からProteinAで精製したIgG抗体を用いた。二次抗体としてHRP標識anti-human IgG biotinylated antibodyを用いて免疫組織化学反応を行った。その結果、シェーグレン症候群患者の腺細胞の核内に陽性所見がみられた。さらに、唾液腺組織または唾液腺培養細胞から蛋白を抽出し、SDS-PAGEで電気泳動した後、イモビロントランスメンブレンに転写後、抗血清、HRP標識二次抗体を用いてECLで抗原を検出した。その結果、複数の蛋白バンドが検出され、SS-AとSS-Bに加え、他の抗核蛋白に対する抗体がシェーグレン患者の血清中に存在することが明らかとなった。今後は、UNIZAP II XRベクターを用いたcDNAライブラリーを作製し、クローニングを行う。

除了Sjogren综合征中淋巴细胞的浸润和增殖以及伽马球蛋白产生的机制，自身抗体及其抗原的起源（组织受损的抗原蛋白）的萎缩和诱导唾液凝固性膜性乳腺粘膜上皮的萎缩和破坏，还没有显示出来。为了克服Sjogren综合征的病理，必须阐明是治疗及其抗原表现机制的分子靶标的组织受损的抗原蛋白。因此，为了阐明可以是治疗性分子靶靶标的抗原蛋白的目的，我们研究了1。纯化Sjogren患者的自身抗体，2。唾液粘膜内自身抗体识别的组织受损的蛋白质。首先，使用患者血清与蛋白质A珠结合γ-球蛋白，然后进行滋润以净化γ-球蛋白。将这些免疫球蛋白分配给小部分，并在-25°C下储存直至使用。为了进行免疫组织化学染色，将正常的唾液腺（下颌下腺，唇腺等）和Sjogren综合征患者的唇腺进行冷冻或石蜡嵌入，并使用冷冻剂或微落膜或微粘液组制成6μm厚的层。作为原代抗体，使用了Sjogren患者抗血清纯化的IgG抗体。使用HRP标记的抗人IgG生物素化抗体作为二抗体进行免疫组织化学反应。结果，在Sjogren综合征患者的腺细胞核中发现了阳性发现。此外，从唾液腺组织或培养的细胞中提取蛋白质，通过SDS-PAGE电泳，然后转移至固定型跨膜，然后使用抗血清和HRP标记的二级抗体通过ECL检测到抗原。结果，检测到多个蛋白质带，并且发现除SS-A和SS-B外，SJOGREN患者的血清中还存在除SS-A和SS-B外的其他抗核蛋白。将来，将准备并克隆使用Unizap II XR载体的cDNA库。

项目成果

Multidrug resistance-associated protein 7 expression is involved in cross-resistance to docetaxel in salivary gland adenocarcinoma cell lines.

• DOI: 10.3892/ijo.30.2.393
• 发表时间: 2007-02
• 期刊: International journal of oncology
• 影响因子: 5.2
• 作者: Hiroko Naramoto;T. Uematsu;T. Uchihashi;R. Doto;T. Matsuura;Y. Usui;S. Uematsu;Xianqi Li;Masahiro Takahashi;M. Yamaoka;K. Furusawa