リガンドスクリーニングのためのケミカルプロテオミクス手法の開発

开发用于配体筛选的化学蛋白质组学方法

基本信息

批准号：
19651089
负责人：
酒井寿郎
金额：
$ 2.18万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

微量に存在する核内受容体蛋白質をターゲットに高親和性抗体-磁気ビーズを用いたプロテオミクスを行うことで、複合体のストイキオメトリーを壊さずに、転写複合体が構造の類似した合成リガンドの濃度・時間によって遷移する様を追跡する系を樹立した。本研究ではバキュロウィルス上に融合蛋白を発現させた蛋白質を免疫する方法によって作成した高親和性抗体(Kd 10-8以下)を低ノイズ磁気ビーズに固定化させ、サンプル調整を行うことにより、現在のプロテオミクス解析を更に効果的なものとした。 3T3-L1脂肪細胞では、スプライソゾームや蛋白のinitiation complexに関わる蛋白など、これまであまり報告のない蛋白が再現良く取れた。さらに、生体内の核内受容体によるシグナルはリガンドの多様性により決定されることから、PPARγの合成された種々近縁の多様なアゴニストリガンドによって変動するデータを比較検討することを行っている。これはアゴニスト作用のある種々類似の薬剤でのプロテオミクスは、大量のデータを意味づけるうえで重要である。しかしながら、PGC1やその他、よく知られたmediator複合体などが逆に検出することが出来なかった。これまでの過剰発現系で見られてきた複合体がネイティブ蛋白レベルで見られない理由については不明である。本研究ではネイティブ蛋白とのストイキオメトリュに重きを置いた研究であるが、アゴニストリガンドによる変動も必ずしも再現が取れるわけではなく更なる最適化が必要である。また、今回新たにPPAγはRXRαのみならずRXRβと複合体を形成することが明らかにされた。さらに、mRNA transportとmRNA locanzationにかかわるミオシン、Translation initiationにかかわるEIF4ファミリーも検出された。ただしこれらは通常細胞質に存在する蛋白であるため、さらに注意深い検討が必要である。CTCFとの複合体コンプレックスも見られ、PPARγの広範囲な機能が推測された。

通过靶向痕量的核受体蛋白，即使用高亲和力抗体磁磁珠的蛋白质组学，我们建立了一个系统，该系统跟踪转录复合物的转变如何取决于与相似结构的合成配体的浓度和时间，而不破坏该复合物的stoichiemetry。在这项研究中，通过在低噪声磁珠上固定在杆状病毒上表达融合蛋白的蛋白质产生的高亲和力抗体（KD 10-8或更少），并进行样品制备以进一步改善电流蛋白质组学分析。在3T3-L1脂肪细胞中，迄今尚未报告的蛋白质被复制和再现，例如参与蛋白质起始复合物的蛋白质。此外，由于体内核受体的信号取决于配体的多样性，因此我们已经比较并检查了与与PPARγ合成的各种密切相关的激动剂配体不同的数据。这对于制作具有各种类似药物的蛋白质组学对具有大量数据有意义的蛋白质组学很重要。但是，无法检测到PGC1和其他众所周知的介体配合物。目前尚不清楚为什么在天然蛋白质水平上找不到以前过表达系统中看到的复合物。这项研究的重点是具有天然蛋白质的化学计量法，但是激动剂配体变异不一定是可重现的，需要进一步优化。还揭示了PPAγ不仅与RXRα而且RXRβ形成复合物。此外，还检测到参与mRNA运输和mRNA定位的肌球蛋白，以及参与翻译启动的EIF4家族。但是，这些是通常存在于细胞质中的蛋白质，因此需要进一步仔细考虑。还观察到了具有CTCF的复杂复合物，并推测了PPARγ的广泛功能。