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心血管細胞内Caイオン代謝蛋白の細胞工学的および遺伝子工学的解析とその臨床応用

心血管细胞内钙离子代谢蛋白的细胞工程和基因工程分析及其临床应用

基本信息

批准号：
01480243
负责人：
豊岡照彦
金额：
$ 4.29万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
财政年份：
1988
资助国家：
日本
起止时间：
1988 至 1990
项目状态：
已结题

项目摘要

現在心筋および血管平滑筋細胞内Ca動態を規定する各種Caチャンネル、CaポンプであるCaATPaseおよびNa^+-Ca^<2+>交換体を遺伝子レヴェルで解析するためその準備を進めているが、まだその結果を供覧する段階に至っていない。本報告では並行して行っている血管平滑筋内Caストアの筋小胞体からのCa2+の放出機構の発現機構に関する研究の進展を報告する。この研究の背景には心筋と血管のCa^<2+>調節系には現在大きな相違は報告されていないので実験結果の解析の容易な血管平滑筋を用いて得られる結果は将来の心筋を用いる研究の重要なヒントとなると予想される。今回血管作動性物質としてエンドセリンー1(ET)を用いた。ごく最近の薬理学実験と遺伝子工学を用いた実験により心筋自身に対しETー1が陽性変力作用と変時作用を示し、また固有の受容体が心筋に発現しており、ETー1が何等かの作用を心にする事は確実であろう。またETは電位依存Caチャンネルに直接作用すると当初考えられたが、その後直接作用は無く、特有の受容体とIP_3による細胞内情報伝達系を介して細胞内Ca^<2+>濃度を変化させると現在考えられている。【方法および結果】細胞内のCa^<2+>の二次元観測法の詳細は既に昨年度報告した。今回は血管平滑筋が細胞増殖や分化の過程でその表現型が変わる事に注目し、(1)細胞分裂を極めて遅くするため0.5%のウシ胎児血清(FCS)を含む培養液、(2)この中の成長因子などを完全に取り除くため、全く血清を含まず、代わりにインシュリン等を含んだ完全無血清培養液、および(3)この系にPDGFを10ng/ml含んだ培養液の3種類の系でエンドセリン(ET)、バゾプレッシン(V)および40mMのK脱分極刺激を行った。なお今回も細胞内Ca^<2+>の筋小胞体(SR)からの放出機構を解析するために前2者では細胞外液に生理的な1mMのCa^<2+>が存在する場合と、Ca^<2+>を外から加えず、かつCa^<2+>を完全にキレ-トするために1mMのEGTAを加えた場合を用いた。K刺激の時には電位依存性Caチャンネルの機能を確認し、かつ一端SRから放出されたCa^<2+>をSRに再度取り込ませる目的で1mMのCa^<2+>共存下で行った。【結果の要約および考案】(1)FCSを0.5%含む培養液で2日間培養後ETには細胞外にCa^<2+>が存在する時は全ての細胞が反応したが、その様式にはET添加後一過性の細胞内Ca^<2+>の上昇相を示した後、平坦な相の2種の反応を呈する群を約半数の細胞が示し、残りの半数の細胞は一過性の相を呈さず、後の平坦相のみ呈した。(2)細胞外にCa^<2+>が存在しない時は一過性の反応のみ呈する約半数の細胞と全く反応しない約半数の細胞とが同一視野内に共存した。次に細胞外に1mMのCa^<2+>が存在し、かつ電位依存性Caチャンネルの阻害薬であるジルチアゼム30myuuM共存する時は、先の細胞外にCa^<2+>の存在しない時と全く同様一過性のCa^<2+>の上昇を示す細胞と示さない無反応の細胞とが共存した。以上から(1)最初の一過性の反応は細胞内のSRから放出されるCa^<2+>の放出を、(2)次の平坦相は、電位依存性Caチャンネルを通過して細胞内に流入するCa^<2+>を観測していると考えた。そして(3)その両方のCa^<2+>動員系は約半分の細胞が占め、残りの半数は電位依存性Caチャンネルのみ有していると考えられた。次に細胞の分化の影響を観察するため、完全無血清培養液で細胞分裂を完全に阻止した場合、95%以上の細胞がETに反応し、PDGFを加えて増殖を起こさせた場合は全ての細胞が全く反応しなくなった。この際だった細胞のCa反応はETに対して選択的に示され、その他のK脱分局による電位依存性Caチャンネルによる細胞内へのCa^<2+>流入の系やETと同じ細胞内信号伝達にIP_3を介すると考えられているVの場合には、こうした細胞周期の影響を全く受けず、無血清培養液でもPDGFの存在する時でも殆ど全ての細胞が反応を呈した。従ってETに対しては無反応でも電位依存性CaチャンネルとIP_3の動員系は完全に保持している事が示された。

The intracellular Ca dynamics of cardiac muscle and vascular smooth muscle are regulated by various Ca ions, Ca ions, Ca ATPase and Na ^+-Ca ^<2 +> exchangers. This report reports on the progress of research related to the mechanisms of Ca2 + release and discovery in vascular smooth muscle cells. The background of this study is that the Ca ^<2 +> regulatory system of cardiac muscle and blood vessels is currently in large contradiction with the report. The results are easy to analyze. The results are important for future research on cardiac muscle. The vasomotor substance is now used in the treatment of acute hypertension. The most recent biological and genetic engineering applications are the identification of the role of ET-1 in the development of the tendon itself, and the identification of the role of ET-1 in the development of the tendon itself. ET is a potential-dependent Ca~(2 +) receptor that directly affects intracellular Ca~(2 +) concentrations. [Methods and Results] The detailed measurement of intracellular Ca ^<2 +> by quadratic method was reported in the annual report. The phenotype of vascular smooth muscle cells in the process of proliferation and differentiation is different,(1) cell division is extremely high, 0.5% of fetal serum (FCS) is contained in culture medium,(2) growth factor in this medium is completely removed, whole serum is contained in culture medium, generation is contained in completely serum-free culture medium, 3. The three kinds of PDGF (10 ng/ml) culture medium containing PDGF (ET), PDGF (V) and PDGF (40 mM) were used for depolarization stimulation. The mechanism of intracellular Ca ^<2 +> release from muscle cells (SR) is analyzed. The first two are used in the presence of physiological Ca ^<2 +> in extracellular fluid. Ca ^<2 +> is added to the extracellular fluid. Ca ^<2 +> is added completely to the extracellular fluid. The function of Ca~(2 +)-dependent Ca~(2 +-dependent Ca~(2 +)-dependent Ca~(2 +)-dependent Ca~(2 +-dependent Ca~(2 +)-dependent Ca~(2 +)-dependent Ca~(2 +-dependent Ca~(2 +)-dependent Ca~ [Results](1) FCS 0.5% culture medium, 2 days after culture, ET, extracellular Ca ^<2 +>, when the whole cell was in reverse phase, after ET was added, transient intracellular Ca ^<2 +>, after the flat phase, 2 kinds of reverse phase, about half of the cells were in reverse phase, and the remaining half of the cells were in reverse phase, after ET was added, transient intracellular Ca ^<2 +>, after ET was added, 2 kinds of reverse phase, about half of the cells were in reverse phase. After the flat phase, the heart is presented. (2)When extracellular Ca ^<2 +> was present, it was transiently inverted, and about half of the cells were completely inverted, and about half of the cells were blue-shifted within the same field of view. In addition, when extracellular Ca <2 +> is present at 1 mM, potential dependent Ca <2 +> production is inhibited by a 30-myuM blue shift, whereas when extracellular Ca <2 +> is present, transient Ca <2 +> rise is observed in cells without a reverse shift. The following are considered: (1) initial transient reaction, Ca ^<2 +> emission from SR in the cell;(2) secondary flat phase reaction, potential-dependent Ca ^<2 +> emission, Ca ^<2 +> influx through the cell. (3) The Ca ^<2 +> mobilization system of the two groups is about half of the cell occupation, and the Ca ^<2 +> mobilization system of the two groups is about half of the cell occupation, and the Ca ^<2 +> mobilization system of the two groups is about half of the cell occupation. The effect of cell differentiation was observed in serum-free culture medium, and cell division was completely prevented. More than 95% of cells were infected with ET and PDGF. The intracellular Ca <2 +> influx system, ET and intracellular signal transduction system, IP_3-mediated cell cycle effects, and serum-free culture medium were investigated. The mobilization system of IP_3 is completely maintained in the absence of reaction.