プロテインキナーゼCによる神経伝達物質トランスポーター機能の制御機構に関する研究

蛋白激酶C调控神经递质转运功能的机制研究

基本信息

批准号：
05670091
负责人：
斎藤尚亮
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

GABAトランスポーターに対する燐酸化酵素の影響を調べるために、アフリカツメガエル卵母細胞発現系を用いた。つまり、ラット脳cDNAライブラリーより、GABAトランスポーター(GAT1)cDNAを用いてGAT1mRNAを合成、卵母細胞に注入することによってGAT1を発現させた。発現したGAT1は、Na^+、Cl^-依存性にGABAを取り込み、その取り込みはニペコチン酸によって、ほぼ完全に抑制された。これらのGAT1発現卵母細胞にプロテインキナーゼC活性化剤であるホルボールエステルを作用させたところ、GABA取り込みは有意に抑制され、その抑制はプロテインキナーゼ阻害薬であるスタウロスポリンによって阻害された。また、Eadie-Hofstee plotで解析したところ、この抑制は細胞外GABAに対する親和性(Km)を低下させることによることが示された。この燐酸化によるGABAトランスポーターの抑制が生理的にも起こりうるかを検討するために、ラット脳シナプトゾームを調整し、プロテインキナーゼCの影響を調べたところ、やはりGABAに対する親和性の低下によるGABA取り込みの抑制が認められた。さらに、GAT1特異抗体による免疫電顕の結果、GAT1は神経終末に存在していることが明らかになった。これらの結果から、神経終末において、GAT1はプロテインキナーゼCによって燐酸化され、GABAに対する親和性が低下し、取り込み抑制が起こることが示唆された。つまり、燐酸化によってGABAシナプス伝達の増強が起こることが推測された。

为了研究磷酸烯酶对GABA转运蛋白的影响，使用了爪蟾卵母细胞表达系统。换句话说，使用GABA转运蛋白（GAT1）cDNA从大鼠脑cDNA文库合成GAT1 mRNA，并通过将其注入卵母细胞来表达GAT1。表达的GAT1以Na^+，Cl^依赖性方式掺入GABA，其摄取几乎被乳糖酸完全抑制。当这些表达GAT1的卵母细胞用佛罗酯（蛋白激酶C活化剂）处理时，GABA摄取受到显着抑制，并被蛋白激酶抑制剂星形孢菌素抑制。此外，Eadie-Hofstee图的分析表明，这种抑制是由于降低细胞外GABA的亲和力（KM）引起的。为了研究这种磷酸化是否可以在生理上引起GABA转运蛋白抑制，我们调节大鼠脑突触体并研究了蛋白激酶C的作用，并发现由于对GABA的亲和力降低，抑制了GABA摄取。此外，具有GAT1特异性抗体的免疫电子显微镜表明，GAT1存在于神经末端。这些结果表明，在神经末端，GAT1被蛋白激酶C磷酸化，从而降低了其对GABA的亲和力，从而抑制了摄取的抑制。换句话说，据推测，磷酸化将导致GABA突触传播增强。