Na^+/Cl^-依存性トランスポーターの分子間相互作用と機能協関する蛋白質の検索

寻找与 Na^+/Cl^- 依赖性转运蛋白的分子间相互作用和功能合作相关的蛋白质

基本信息

批准号：
09257229
负责人：
斎藤尚亮
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、Na^+/Cl^-依存性トランスポーターの一種であり、感情障害の原因とも考えられているセロトニントランスポーター(SET)に注目し、SETと結合し機能協関する蛋白質の検索と機能解析を目的とした。SETの生理機能を解析するために、まず、リン酸化、脱リン酸化によってSETの機能がどのように修飾されるかを検討した。SET活性は、PKCの活性化により有意に抑制され、その抑制はリン酸化酵素阻害薬によって完全に阻害された。また、不活性型のホルボールエステルはこのような抑制効果を示さなかった。また、フォスファターゼ1および2Aの阻害剤であるカリクリンAも同様にSET活性を抑制し、そのカリクリンによる抑制もリン酸化酵素阻害薬によって阻害された。これらの事実により、SET活性はリン酸化、脱リン酸化のバランスによって制御されていることが示された。Eadie-Hofstee解析により、このTPAやCLAによる制御はSETのセロトニンに対する親和性には影響を与えず、最大取り込み速度の抑制によることが示された。このプロテインキナーゼCによるリン酸化が、直接のリン酸化によるものであるかどうかを検討するために、site-directed mutagenesisを用いて、5カ所のリン酸化されうると推定されるそれぞれのセリンあるいはトレオニン残基を変異させた変異体を作製し、リン酸化、脱リン酸化の影響を検討した。その結果、すべてのリン酸化されうる部位を変異させても、TPA、CLAの効果が認められ、少なくともこの5カ所は直接リン酸化されないことが明らかになった。これらの結果から、SETはリン酸化・脱リン酸化酵素によって、間接的に制御されておいることが示唆された。今後、その間接的な制御機構を分子レベレで解明するためにSET結合蛋白の単離を行う予定である。

在这项研究中，我们专注于羟色胺转运蛋白（SET），这是一种Na^+/Cl^依赖性转运蛋白的类型，被认为是情绪障碍的原因，旨在寻找与功能结合并配合功能并分析功能分析的蛋白质。为了分析集合的生理功能，我们首先研究了集合的功能如何通过磷酸化和去磷酸化来修饰。 PKC的激活可显着抑制固定活性，而PKC被磷酸烯酶抑制剂完全抑制。此外，非活性佛波酯没有表现出这种抑制作用。此外，磷酸酶1和2a的抑制剂kaliculin A类似地抑制了凝固活性，磷酸烯酶抑制剂也抑制了卡酸蛋白的抑制作用。这些事实表明，集合活性是由磷酸化和去磷酸化平衡控制的。 EADIE-HOFSTEE分析表明，TPA或CLA的这种对照不影响SET对5-羟色胺的亲和力，并且是由于抑制最大摄取率而引起的。为了研究蛋白激酶C的这种磷酸化是否是由于直接磷酸化引起的，使用位置定向的诱变来创建具有突变的丝氨酸或苏氨酸残基的突变体，这些突变体预测在五个位置被磷酸化，并研究了磷酸化和去磷酸化的作用。结果，发现即使所有可能的磷酸化位点被突变，也观察到了TPA和CLA的作用，并且至少这五个位点没有直接磷酸化。这些结果表明，集合受磷酸化和去磷酸化酶间接调节。将来，我们计划分离结合蛋白，以阐明分子水平的间接调节机制。