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蛍光標識プロテインキナーゼCの遺伝子改変マウスの作製とその神経可塑性研究への応用

荧光标记蛋白激酶C转基因小鼠的构建及其在神经可塑性研究中的应用

基本信息

批准号：
09259223
负责人：
斎藤尚亮
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、長期増強、長期抑圧現象におけるプロテインキナーゼC(PKC)分子種の役割を明らかにすることを目的とし、PKC各分子種のトランスロケーション現象の解析を行い、活性化型PKCとリン酸化基質の空間的関係を形態学的に解析することを目的とした。本年度は神経系に多く存在するPKC分子種のうち、シナプス後部に存在するγ-分子種に焦点を当て研究を行った。γ-PKCにGFP融合した蛋白質を細胞に発現させ、コンフォーカル顕微鏡下でGFP蛍光を指標として種々の細胞外刺激によるPKCの細胞内動態を経時的に記録した。刺激後のGFP蛍光の局在は、免疫蛍光染色によるそれぞれのPKC分子種の局在と一致しており、また、Immunoblotによってもγ-PKC-GFPの分解産物が認められなかったことから、経時的に観察したGFP蛍光はPKC自体の動態をあらわすものと考えられた。また、酵素学的な解析によりγ-PKC-GFPもγ-PKCと同様の酵素学的特性を持つことが明らかとなり、GFPの融合によってもγ-PKCの特性には影響が少ないと考えられた。このGFP融合PKC分子種を用いて1)TPAによるtranslocationは比較的遅い時間経過で起こり、irreversibleであった、2)CaイオンによるtranslocationおよびG蛋白質結合型受容体の刺激によるtranslocationも20sec以内に細胞膜にtranslocationし、3min以内に元の状態に戻る速くreversibleなものであった。また、site-directed mutagenesisを用いた実験により、受容体の刺激によるtranslocationには、Caイオン、C2 domainは必須であるが、TPAによるtranslocationには、Caion,C2 domainは必須ではないことが明らかになった。

The purpose of this study is to clarify the mechanism of long-term enhancement and depression of PKC molecular species, to analyze the mechanism of PKC molecular species, to analyze the spatial relationship between activated PKC and acidified matrix, and to analyze the morphology. This year, we will focus on the study of PKC molecular species and γ-molecular species.γ-PKC GFP fusion protein expression in cells, GFP fluorescence under microscope, extracellular stimulation, PKC intracellular dynamics during recording After stimulation, GFP fluorescence was detected in the presence of PKC molecular species by Immunoblot staining, and the degradation products of γ-PKC-GFP were detected in the presence of PKC itself. The enzymatic properties of γ-PKC-GFP and γ-PKC homologues are closely related to the enzymatic properties of γ-PKC. The GFP fusion PKC molecular species is used in 1)TPA translocation, which is faster than the time of initiation, irreversible, 2)Ca (II) translocation, and G protein-binding receptor stimulation within 20sec, translocation, and 3min, which is faster than the time of initiation. TPA, site-directed mutagenesis, receptor stimulation, translocation, Caion, C2 domain must be translocation, Caion,C2 domain must be translocation.