プレニルトランスフェラーゼの酵素活性発現機構

异戊二烯基转移酶酶活性的表达机制

• 批准号: 05680496
• 负责人: 古山 種俊
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05680496/
• 关键词: プレニルトランスフェラーゼ; ファルネシル二リン酸; イソプレン鎖延長反応; 耐熱性酵素; 人工基質ホモログ; 結晶化酵素; イソプレノイド; イソペンテニル二リン酸

中等度好熱性細菌Bacillus stearothermophilusのプレニルトランスフェラーゼの一種,ファルネシル二リン酸(FPP)合成酵素の遺伝子クローニングを行い,その塩基配列を決定して,大腸菌内でこの耐熱性酵素を大量に産生する系を確立した.大腸菌の全タンパク量の約20%にまで産生されるようになったFPP合成酵素は,55℃で1時間の熱処理とブチルトヨパールおよびMonoQの2種のクロマトグラフィーにて,単一に精製される.大量に純化した酵素を用いて結晶化を試みたところ,蒸気拡散法,ハンギングドロップ法のいずれでも結晶を得る事が出来た.現在,東京工業大学の三木研究室との共同研究として,このFPP合成酵素のX線結晶構造解析を進行中である.この酵素の遺伝子の塩基配列に基づいて推定される酵素の一次構造を,既にクローニングされている6種のプレニルトランスフェラーゼ(FPP合成酵素4種,ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素1種,ヘキサプレニル二リン酸合成酵素1種)の一次構造と比較した結果,プレニルトランスフェラーゼには生物の種を越えてよく保存されている7つの領域(A-G)が存在する事が分かった.C末端部にあるG領域には塩基性アミノ酸が多く保存されているが,この部分に点変異を導入し,酵素活性の変化を解析した結果,この領域は基質イソペンテニル二リン酸(IPP)の結合部位に近い位置に存在している事が分かった.このことはさらに,G領域の上流部分に存在するCys-289とIPPの結合部位と推定されているB領域に存在するCys-73(このFPP合成酵素にはCysはこの2個のみである)への点変異導入の結果とも符合した.すなわち,この2つのCysは酵素活性発現には必須ではないが,Cys-289の点変異体ではIPPに対するKm値が野生型の酵素より著しく大きくなった.また,この酵素は酸化的条件下で容易にジスルフィド結合を形成する事も明かとなった.

Moderate thermophilic bacteria Bacillus Stearothermophilus の プ レ ニ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の a, フ ァ ル ネ シ ル two リ ン acid (FPP) synthetic enzyme の posthumous son 伝 ク ロ ー ニ ン グ を い, そ の salt base with column を decided し て, coliform in で こ の heat resistant enzymes を a lot に す を る department establish し た. Coliform の full タ ン パ ク の about 20% に ま で produce さ れ る よ う に な っ た synthesis enzyme は FPP, 55 ℃ で 1 time の hot 処 と ブ チ ル ト ヨ パ ー ル お よ び MonoQ の two の ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に て, 単 a に refined さ れ る. Large に purification し を た enzyme with い て crystallization を try み た と こ ろ, steamed 気 company, dispersion method, ハ ン ギ ン グ ド ロ ッ プ method の い ず れ で も crystallization を た が る things out. Now, Tokyo の sunwood industrial university laboratory と の joint research と し て, こ の FPP synthetic enzyme の X-ray crystal structure during parsing を で あ る. こ の enzyme の heritage 伝 son の salt base with column に base づ い て presumption さ れ る enzyme の を a construction, both に ク ロ ー ニ ン グ さ れ て い る six の プ レ ニ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ (FPP enzyme synthesis Four, ゲ ラ ニ ル ゲ ラ ニ ル two リ ン acid synthesis enzyme 1, ヘ キ サ プ レ ニ ル two リ ン acid synthesis enzyme 1) の A tectonic と compare し た results, プ レ ニ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ に は creature の を more え て よ く save さ れ て い る 7 つ の field (A - G) が す る matter が points か っ た. C terminal part に あ る G に は salt Basic ア ミ ノ acid が く save more さ れ て い る が, こ の part に point - を import し, enzyme activity の variations change を parsing し た results, こ は の field matrix イ ソ ペ ン テ ニ ル two リ ン acid (IPP) の combining site に nearly い position に し て い る matter が points か っ た. こ の こ と は さ ら に, G の upper part に exist す る Cys - 2 89 と IPP の combining site と presumption さ れ て い る に B field exist す る Cys - 73 (こ の FPP synthetic enzyme に は Cys は こ の 2 の み で あ る) へ の points - different import の results と も conform to し た. す な わ ち, こ の 2 つ の Cys は enzyme activity 発 now に は must で は な い が, Cys - 289 の - variant で は IPP に す seaborne る Km numerical が wild-type の enzyme よ り the し く big き く な っ た. ま た, こ の で に easily under the condition of enzyme は acidification ジ ス ル フ ィ ド combined を form す る matter も Ming か と な っ た.

项目成果

Ohnuma,Shin-ichi: "Alteration of the Product Specificities of Prenyltransferases by Metal Ions" Biochem.Biophys.Res.Commun.192. 407-412 (1993)

Ohnuma，Shin-ichi：“金属离子对异戊二烯基转移酶产品特异性的改变”Biochem.Biophys.Res.Commun.192。

Koyama,Tanetoshi: "Thermostable Farnesyl Diphosphate Synthase of Bacillus stearothermophilus:Molecular Cloning,Sequence Determination,Overproduction,and Purification" J.Biochem.113. 355-363 (1993)

Koyama，Tanetoshi：“嗜热脂肪芽孢杆菌的耐热法尼基二磷酸合成酶：分子克隆、序列测定、过量生产和纯化”J.Biochem.113。

Nakane,Hiroyuki: "Crystallization and Preliminary X-ray Diffraction Studies of Bacillus stearothermophilus Farnesyl Diphosphate Synthase Expressed in Escherichia coli" J.Mol.Biol.233. 787-788 (1993)

Nakane、Hiroyuki：“大肠杆菌中表达的嗜热脂肪芽孢杆菌法尼基二磷酸合酶的结晶和初步 X 射线衍射研究”J.Mol.Biol.233。

Koyama,Tanetoshi: "Site-directed Mutagenesis of Farnesyl Diphosphate Synthase;Effect of Substitution for the Three Carboxyl-Terminal Amino Acids" Canadian J.Chem.(in press).

Koyama，Tanetoshi：“法尼基二磷酸合酶的定点诱变；三个羧基末端氨基酸的取代效应”加拿大化学杂志（正在出版）。

古山,種俊: "新タンパク質応用工学 第11章第4節" フジテクノシステムズ(株), (1994)

Furuyama，Tanetoshi：“新蛋白质应用工程第 11 章第 4 节”Fuji Techno Systems Co., Ltd.（1994 年）