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プレニルトランスフェラーゼの酵素活性発現機構

异戊二烯基转移酶酶活性的表达机制

基本信息

批准号：
05680496
负责人：
古山種俊
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

中等度好熱性細菌Bacillus stearothermophilusのプレニルトランスフェラーゼの一種,ファルネシル二リン酸(FPP)合成酵素の遺伝子クローニングを行い,その塩基配列を決定して,大腸菌内でこの耐熱性酵素を大量に産生する系を確立した.大腸菌の全タンパク量の約20%にまで産生されるようになったFPP合成酵素は,55℃で1時間の熱処理とブチルトヨパールおよびMonoQの2種のクロマトグラフィーにて,単一に精製される.大量に純化した酵素を用いて結晶化を試みたところ,蒸気拡散法,ハンギングドロップ法のいずれでも結晶を得る事が出来た.現在,東京工業大学の三木研究室との共同研究として,このFPP合成酵素のX線結晶構造解析を進行中である.この酵素の遺伝子の塩基配列に基づいて推定される酵素の一次構造を,既にクローニングされている6種のプレニルトランスフェラーゼ(FPP合成酵素4種,ゲラニルゲラニル二リン酸合成酵素1種,ヘキサプレニル二リン酸合成酵素1種)の一次構造と比較した結果,プレニルトランスフェラーゼには生物の種を越えてよく保存されている7つの領域(A-G)が存在する事が分かった.C末端部にあるG領域には塩基性アミノ酸が多く保存されているが,この部分に点変異を導入し,酵素活性の変化を解析した結果,この領域は基質イソペンテニル二リン酸(IPP)の結合部位に近い位置に存在している事が分かった.このことはさらに,G領域の上流部分に存在するCys-289とIPPの結合部位と推定されているB領域に存在するCys-73(このFPP合成酵素にはCysはこの2個のみである)への点変異導入の結果とも符合した.すなわち,この2つのCysは酵素活性発現には必須ではないが,Cys-289の点変異体ではIPPに対するKm値が野生型の酵素より著しく大きくなった.また,この酵素は酸化的条件下で容易にジスルフィド結合を形成する事も明かとなった.

Medium-grade Bacillus stearothermophilus bacteria, high-grade bacteria, low-grade bacteria, low-grade bacteria, moderate-grade bacteria, moderate-grade The total amount of aseptic bacteria is about 20%. The total amount of FPP synthesis enzyme is about 20%. The temperature is 55 ℃ and the temperature is 1 hour. the temperature is 55 ℃ and the temperature is 1 hour. the temperature is 55 ℃ and the temperature is 1 hour. there are two kinds of MonoQ. A large number of ferment enzymes were crystallized by the method of crystallization, steaming and dispersion, and the results were obtained by the method of crystallization. Now, the Miki Research Laboratory of Beijing University of Technology has jointly studied and analyzed the X-ray crystal analysis of FPP synthesis enzymes. The base sequence of the enzyme enzyme is based on the presumption that the enzyme can be produced once, and the results of the comparison test can be made by using 6 kinds of FPP synthetic enzymes (4 FPP synthetic enzymes, 1 dicarboxylic acid synthetic enzyme and 1 maleic acid synthetic enzyme). Do you want to know how to save your life? you need to know that there is a problem in your field (AmurG). At the end of C, you have a lot of information in the field of acid. the results of the analysis of the results of the analysis of the results of enzyme activity analysis. In the field, there is a significant difference in the location of bivalent acid (IPP) in the vicinity of the joint. It is presumed that there is an Cys-289 in the upper stream of the G domain. There is a Cys-73 (two FPP synthase Cys clusters) in the field B. the results of the import test are in accordance with the criteria. The activity of Cys enzyme must be affected in order to realize the activity of Km enzyme. The enzyme activity of wild type enzyme must be affected by the enzyme activity of Cys-289. Under the condition of enzyme acidification, it is easy to combine the enzyme to form a clear reaction.