細菌の細胞膜間糖輸送過程に関与する酵素フリッパーゼの実体の解明

阐明参与细菌膜间糖转运过程的翻转酶实体

• 批准号: 12878109
• 负责人: 古山 種俊
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12878109/
• 关键词: プレニル鎖延長酵素; ウンデカプレニル二リン酸; プレニルトランスフェーラーゼ; フリップ-フロップ; 細胞膜生合成; 糖担体脂質; フリッパーゼ; フリップ-フロッブ; 細菌細胞壁生合成; ウンデカプレニルニリン酸; ペプチドグリカン; 糖タンパク質生合成; ドリコールリン酸; プレニルトランスフェラーゼ

細菌の細胞壁の生合成は脂質中間体LiPid IIにおけるオリゴ糖鎖のコア構造が細胞質内で構築され、糖坦体リピドと結合したものが細胞内膜側から外膜側へ「フリップ-フロップ転移」されて、細胞表面でのペプチドグリカン層生合成に供給される。このオリゴ糖の膜間移送過程(フリップ-フロップ転移)は教科書レベルでも記述されているにも拘わらず、その過程に関与する酵素「フリッパーゼ」の実体は全く明らかになっていない。この過程に関与する糖坦体リピド、ウンデカプレニルリン酸の前駆体を合成する酵素、ウンデカプレニル二リン酸合成酵素(UPS)をシス型プレニル鎖延長酵素として初めてクローン化し、そのX線結晶構造解析に成功しているので、フリッパーゼの実態を解明し、その分子レベルでの解明の糸口を見出すことを本研究の目的とした。先ず、UPSの大量発現系を利用して、ウンデカプレニル二リン酸の大量合成系を確立し、UDP-MurNAc-pentapeptideをBacillus cereusの培養液から抽出し、Phospho-MurNAc-pentapeptide transferaseの発現系を構築して、LiPid Iの酵素的合成法の確立を試みたが、大量合成法は構築できなかった。そこで、ウンデカプレニルリン酸のリン酸基にアミノエチル基がジエステル結合した化合物を合成し、このアミノ基に蛍光発色団7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl基を導入した化合物を合成した。さらにこの化合物のプレニル基をファルネシル基、またはゲラニルゲラニル基に置換た化合物も合成し、ウンデカプレニルリン酸が細胞膜の外膜から内膜ヘフリップ-フロップ転移により回収される過程を追究することにした。現在、合成した化合物を大腸菌野生株W3110株より調整した細胞膜成分に効率よく導入する方法を検討中である。

The cell walls of bacteria の の biosynthesis は LiPid intermediates LiPid II に お け る オ リ ゴ sugar lock の コ ア structure the cytoplasm で が build さ れ, body sugar リ ピ ド と combining し た も の が cells lining the lateral か ら outer membrane side へ "フ リ ッ プ - フ ロ ッ プ planning shift" さ れ て, cell surface で の ペ プ チ ド グ リ カ ン layer biosynthesis に supply さ れ る. こ の オ リ ゴ sugar の transfer process between membrane (フ リ ッ プ - フ ロ ッ プ planning move) は textbooks レ ベ ル で も account さ れ て い る に も detained わ ら ず, そ の process に masato and す る enzyme "フ リ ッ パ ー ゼ" の be は whole body く Ming ら か に な っ て い な い. こ の process に masato and す る sugar temple body リ ピ ド, ウ ン デ カ プ レ ニ ル リ ン acid の 駆 body before を synthetic す る enzyme, ウ ン デ カ プ レ ニ ル two リ ン acid synthetase (UPS) を シ ス type プ レ ニ ル lock to extend the enzyme と し て early め て ク ロ ー ン し, そ の X-ray crystal structure parsing に successful し て い る の で, フ リ ッ パ ー ゼ の state be を interpret し, The そ そ molecule レベ で で で そ clarifies the を title を reveals す とを とを とを the purpose of this study と た た. First ず, UPS の large 発 now を using し て, ウ ン デ カ プ レ ニ ル two リ ン acid の large GeChengXi を establishing し, UDP - MurNAc - pentapeptide を Bacillus cereus の culture か ら spare し, Phospho - MurNAc - pentapeptide The development of transferase is を to construct て, the synthesis method of LiPid I enzyme is established を test みたが, and the mass synthesis method is <s:1> to construct で な な った った. そ こ で, ウ ン デ カ プ レ ニ ル リ ン acid の リ ン acid radical に ア ミ ノ エ チ ル base が ジ エ ス テ ル combining し を た compounds synthesis し, こ の ア ミ ノ base に 蛍 発 light color 団 7 - nitrobenz - 2 - oxa - 1, 3-4 - yl diazol - base を import し を た compounds synthesized し た. さ ら に こ の compound の プ レ ニ ル base を フ ァ ル ネ シ ル base, ま た は ゲ ラ ニ ル ゲ ラ ニ ル に replacement し も た compounds synthesis, ウ ン デ カ プ レ ニ ル リ が ン acid membrane の outer membrane か ら lining ヘ フ リ ッ プ - フ ロ ッ プ planning move に よ り back 収 さ れ す を る process investigated る こ と に し た. Now, synthetic し た compound を coliform wild seedlings よ W3110 り adjustment し た membrane composition に sharper rate よ く import す る method を 検 beg in で あ る.

项目成果

N.Ohya, T.Koyama: "Biopolymers, volume 2, Polyisoprenoids Chapter 4. Biosynthesis of Natural Rubber and Other Natural Polvisoprenoids"Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim. 37 (2001)

N.Ohya，T.Koyama：“生物聚合物，第 2 卷，聚异戊二烯第 4 章。天然橡胶和其他天然聚异戊二烯的生物合成”Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim。

Y.-W.Zhang and T.Koyama: "Chapter 5.Biosynthesis Routes Diverting from Intrmediates of Polyisoprenoid Biosynthesis to Related Products of the Metabolism"Biopolymers, Volume 2, Polyisoprenoids, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim, T.Koyama and S.Steinbuhel eds

Y.-W.Zhang 和 T.Koyama：“第 5 章：从类聚异戊二烯生物合成中间体转向代谢相关产物的生物合成路线”Biopolymers，第 2 卷，类聚异戊二烯，Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim、T.Koyama 和 S

M.Nagaki, K.Kimura, H.Kimura, Y.Maki, E.Goto, T.Nishino, T.Koyama: "Artificial Substrates of Medium-Chain Elongation Enzymes, Hexaprenyl-and Heptaprenyl Diphosphate Synthases"Bioorg. Med, Chem. Lett.. 11. 2157-2159 (2001)

M.Nagaki、K.Kimura、H.Kimura、Y.Maki、E.Goto、T.Nishino、T.Koyama：“中链延伸酶、六戊二烯基和庚戊二烯基二磷酸合成酶的人工底物”Bioorg。

Y.Kharel, Y-W.Zhang, M.Fujihashi, K.Miki, T.Koyama: "Identification of Significant Residues for Homoallylic Substrate Binding of Micrococcus luteus B-P 26 Undecaprenyl Diphosphate Synthase"J. Biol. Chem.. 276. 28459-28464 (2001)

Y.Kharel、Y-W.Zhang、M.Fujihashi、K.Miki、T.Koyama：“藤黄微球菌 B-P 26 十一碳二烯基二磷酸合成酶同烯丙基底物结合的重要残基的鉴定”J。

T.Koyama,Y.Gotoh,and T.Nishino: "Intersubunit Location of the Active Site of Farnesyl Diphosphate Synthase-Reconstitution of Active Enzymes by Hybrid-type Heteromeric Dimers of Site-Directed Mutants"Biochemistry. 39・2. 463-469 (2000)

T. Koyama、Y. Gotoh 和 T. Nishino：“法尼基二磷酸合酶活性位点的亚基间位置 - 通过定点突变体的混合型异聚二聚体重建活性酶”生物化学 39・2。 (2000)