プレニルトランスフェラーゼの酵素活性発現機構

异戊二烯基转移酶酶活性的表达机制

基本信息

批准号：
07680620
负责人：
古山種俊
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究はイソプレノイドの生合成に重要な「プレニルトランスフェラーゼ」の構造と機能解明を目的として、下記の成果を得た。1. Bacillus stearothermophilusのファネシル二リン酸(C_<15>-PP)合成酵素について(1)部位特異的変異の導入によって(a)アリル性基質の結合に必須なアミノ酸残基として、保存領域VIのGlnが、(b)イソペンテニル二リン酸の結合に重要なアミノ酸残基として保存領域IとVに存在するLysおよび領域VIのDDxxDモチーフの最後のAspが同定できた。(c)触媒反応に直接関与している残基として保存領域VIのFQxxDDxxDモチーフの内のPhe,および1,2番目の2つのAspが同定され、特にPheは反応の律速段階であるアリル性カチオンの生成と安定化に寄与している可能性が示唆された。2. Bacillus stearothermophilusのヘプタプレニル二リン酸(C_<35>-PP)合成酵素遺伝子のクローニングプレニルトランスフェラーゼに特徴的な7つの保存領域の配列を考慮してプライマーを合成し、PCRによって増幅されるクローンを得、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った結果、C_<35>-PP合成酵素遺伝子のクローン化に成功した。酵素の発現の有無を指標にしたクローンの特定化により、この酵素はヘテロサブユニット構造を持っていることが遺伝子レベルで証明できた。3. Micrococcus luteus B-P 26のヘキサプレニル二リン酸(C_<30>-PP)合成酵素遺伝子のクローニング2の場合と同様のプライマーを用いて、PCRやサザンバイブリゼーションを行って得たクローンをプローブとして、C_<30>-PP合成酵素遺伝子およびC_<15>-PP合成酵素遺伝子のクローン化に成功した。C_<30>-PP合成酵素は常に解離しているヘテロサブユニット構造を持つことが証明された。

这项研究旨在阐明“前转移酶”的结构和功能，这对于异普内亚生物合成很重要，并获得了以下结果。 1. For the Fanesyldiphosphate (C_<15>-PP) Synthetic enzyme of Bacillus stearothermophilus (1) Introduction of site-directed mutations allowed the identification of Gln in conserved region VI as an amino acid residue essential for binding of allicular substrates, and (b) the final Asp of the DDxxD motif of Lys and region VI, which are present in conserved regions I and V作为氨基酸残基对于等二磷酸盐的结合很重要。（c）保守区域VI的FQXXDDXXD基序中的PHE和1和2 ASP被鉴定为直接参与催化反应的残基，这表明PHE可能特别有助于反应的速率限制步骤的产生和稳定。 2。将芽孢杆菌二磷酸芽孢杆菌（C_ <35> -pp）合成酶基因引物的克隆合成，并考虑到七个保守区域的特征的七个保守区域的序列，并通过PCR进行了pcr的克隆，并使用了35个探测器，并<35 eppece <合成酶基因成功克隆。通过使用酶表达的存在或不存在作为指标，在基因水平上证明该酶具有异育结构。 3。使用与2中相同的引物，将己酸己酸六角二磷酸（C_ <30> -pp）合酶基因B-P 26克隆，我们成功地克隆了C_ <30> PPP合成基因基因和C_ <15> -PP的基因，并使用PCR和Southern biolation cropte of Crone获得C_ <15> -PP的基因。 C_ <30> -PP合酶已被证明具有不断分离的异质增生结构。