プレニルトランスフェラーゼの酵素活性発現機構

异戊二烯基转移酶酶活性的表达机制

• 批准号: 07680620
• 负责人: 古山 種俊
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07680620/
• 关键词: ファルネシル二リン酸; プレニルトランスフェラーゼ; イソプレン鎖延長; プレニル二リン酸; 合成酵素; ポリプレニール; 遺伝子クローニング; イソプレノイド生合成

本研究はイソプレノイドの生合成に重要な「プレニルトランスフェラーゼ」の構造と機能解明を目的として、下記の成果を得た。1. Bacillus stearothermophilusのファネシル二リン酸(C_<15>-PP)合成酵素について(1)部位特異的変異の導入によって(a)アリル性基質の結合に必須なアミノ酸残基として、保存領域VIのGlnが、(b)イソペンテニル二リン酸の結合に重要なアミノ酸残基として保存領域IとVに存在するLysおよび領域VIのDDxxDモチーフの最後のAspが同定できた。(c)触媒反応に直接関与している残基として保存領域VIのFQxxDDxxDモチーフの内のPhe,および1,2番目の2つのAspが同定され、特にPheは反応の律速段階であるアリル性カチオンの生成と安定化に寄与している可能性が示唆された。2. Bacillus stearothermophilusのヘプタプレニル二リン酸(C_<35>-PP)合成酵素遺伝子のクローニングプレニルトランスフェラーゼに特徴的な7つの保存領域の配列を考慮してプライマーを合成し、PCRによって増幅されるクローンを得、これをプローブとしてハイブリダイゼーションを行った結果、C_<35>-PP合成酵素遺伝子のクローン化に成功した。酵素の発現の有無を指標にしたクローンの特定化により、この酵素はヘテロサブユニット構造を持っていることが遺伝子レベルで証明できた。3. Micrococcus luteus B-P 26のヘキサプレニル二リン酸(C_<30>-PP)合成酵素遺伝子のクローニング2の場合と同様のプライマーを用いて、PCRやサザンバイブリゼーションを行って得たクローンをプローブとして、C_<30>-PP合成酵素遺伝子およびC_<15>-PP合成酵素遺伝子のクローン化に成功した。C_<30>-PP合成酵素は常に解離しているヘテロサブユニット構造を持つことが証明された。

This study は イ ソ プ レ ノ イ ド の biosynthesis に important な "プ レ ニ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ" purpose と function and interpret を の structure と し て, remember の results を た. 1. Bacillus Stearothermophilus の フ ァ ネ シ ル two リ ン acid (C_ < 15 > - PP) synthetic enzyme に つ い て (1) the site specific - different の import に よ っ て (a) ア リ ル sex matrix の must combine に な ア ミ ノ acid residues と し て, save the VI の Gln が, (b) イ ソ ペ ン テ ニ ル two リ の combining に ン acid Important な ア ミ ノ acid residues と し て preservation areas I と V に exist す る Lys お よ び field VI の DDxxD モ チ ー フ の finally の Asp が with fixed で き た. (c) catalyst against 応 に masato directly with し て い る residues と し て preservation areas VI の FQxxDDxxD モ チ ー フ の の within Phe, お よ び 1, 2 times eye の 2 つ の Asp が with fixed さ れ, に Phe は anti 応 の law speed Duan Jie で あ る ア リ ル sex カ チ オ ン の generated と stabilization に send し て い が る possibility in stopping さ れ た. 2. Bacillus Stearothermophilus の ヘ プ タ プ レ ニ ル two リ ン acid (C_ < > 35 - PP) synthetic enzyme heritage 伝 son の ク ロ ー ニ ン グ プ レ ニ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ に な 7 of 徴 つ の の save field match column を consider し て プ ラ イ マ ー を synthetic し, PCR に よ っ て rights of さ れ る ク ロ ー ン を, こ れ を プ ロ ー ブ と し て ハ イ ブ リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を line っ た results, C_ < > 35 - traces of PP synthetic enzyme 伝 son の ク ロ ー ン change に successful し た. Enzyme の 発 is の presence of を index に し た ク ロ ー ン の specialization に よ り, こ の enzyme は ヘ テ ロ サ ブ ユ ニ ッ ト tectonic を hold っ て い る こ と が posthumous son 伝 レ ベ ル で prove で き た. 3. Micrococcus luteus B-P 26 の ヘ キ サ プ レ ニ ル two リ ン acid (C_ > < 30 - PP) synthetic enzyme heritage 伝 son の ク ロ ー ニ ン グ 2 と の occasions with others の プ ラ イ マ ー を with い て, PCR や サ ザ ン バ イ ブ リ ゼ ー シ ョ ン を line っ て have た ク ロ ー ン を プ ロ ー ブ と し て, C_ > < 30 - traces of PP synthetic enzyme 伝 son お よ び C_ < 15 > - PP The synthase 伝 zygine ロ ロ に esterification に success た た. The synthetic enzyme of C_<30>-PP is often に dissociated, and the structure of the て るヘテロサブユニット るヘテロサブユニット るヘテロサブユニット is を, which is supported by the proof of された された とが とが.

项目成果

小倉,協三: "新しい酵素研究法6:イソプレノイド生合成酵素の分子機構" 東京化学同人(株), 13 (1995)

小仓恭三：“新酶研究方法6：类异戊二烯生物合成酶的分子机制”东京化学同人株式会社，13（1995）

古山,種俊: "新タンパク質応用工学 バイオサイエンスへの有機化学の寄与" フジテクノシステムズ(株), 11 (1996)

Furuyama、Tanetoshi：“新蛋白质应用工程：有机化学对生物科学的贡献” Fuji Techno Systems Co., Ltd.，11 (1996)

Koyama, Tanetoshi: "Significance of Phe-220 and Gln-221 in the Catalytic Mechanism of Farnesyl Diphosphate Synthase of Bacillus stearothermophilus" Biochem. Biophys. Res. Commun.212. 681-686 (1995)

Koyama，Tanetoshi：“Phe-220 和 Gln-221 在嗜热脂肪芽孢杆菌二磷酸法呢基合成酶催化机制中的意义”Biochem。

Ohnuma, Shin-ichi: "Conversion from Farnesyl Diphosphate Synthase to Geranylgeranyl Diphosphate Synthse by Random Chemical Mutagenesis." J. Biol. Chem.271 (in press). (1996)

Ohnuma，Shin-ichi：“通过随机化学诱变将法尼基二磷酸合成酶转化为香叶基香叶基二磷酸合成酶。”

Koike-Takeshita, Ayumi: "Molecular Cloning and Nucleotide Sequences of the Genes for Two Essential Proteins Constituting a Novel Enzyme System for Heptaprenyl Diphosphate Synthesis" J. Biol. Chem.270. 18396-18400 (1995)

Koike-Takeshita，Ayumi：“构成庚烯基二磷酸合成的新型酶系统的两种必需蛋白质的基因的分子克隆和核苷酸序列”J. Biol。