細菌の細胞壁生合成における糖のフリップ-フロップ輸送を促進する因子の解明

阐明细菌细胞壁生物合成中促进糖翻转转运的因素

• 批准号: 13024211
• 负责人: 古山 種俊
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2001
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2001 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-13024211/
• 关键词: 糖坦体リピド; ウンデカプレニル二リン酸; フリップ-フロップ転移; プレニル鎖延長酵素; 細胞壁生合成; ファルネシルニリン酸

細菌の細胞壁ペプチドグリカン層の生合成は脂質中間体Lipid IIにおけるオリゴ糖鎖のコア構造が細胞質内で構築され、糖坦体リピド、ウンデカプレニルリン酸と結合したものが細胞内膜側から外膜側へ「フリップ-フロップ転移」されて、細胞表面でのペプチドグリカン層生合成に供給される。この酵素の実態を解明するために、われわれはこの過程に関与する糖坦体リピド、ウンデカプレニルリン酸の前駆体を合成する酵素、ウンデカプレニルニリン酸合成酵素(UPS)をシス型プレニル鎖延長酵素として初めてクローン化し、そのX線結晶構造解析に成功しているので、UPSの大量発現系を利用することで、標的酵素「フリッパーゼ」の基質合成を行って、細菌の細胞壁生合成における未解明な過程の触媒である「フリッパーゼ」の実態を解明し、その分子レベルでの解明の糸口を見出すことを本研究の目的とした。先ず、UPSの大量発現系を利用して得たUPSを用いてウンデカプレニルニリン酸の大量合成系を確立し、UDP-MurNAc-pentapeptideをBacillus cereusの培養液から抽出し、Phospho-MurNAc-pentapeptide transferase(MraY)の発現系を構築して、Lipid Iの酵素的合成浩の確立を試みたが、大量合成法は構築できなかった。そこで、ウンデカプレニルリン酸のリン酸基にアミノエチル基がジエステル結合した化合物を合成し、このアミノ基に蛍光発色団としてNBD(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)基を導入した化合物(1)を合成した。さらに(1)のプレニル基をファルネシル基、またはゲラニルゲラニル基に置換した化合物も合成し、ウンデカプレニルリン酸が細胞膜の外膜から内膜へフリップ-フロップ転移により回収される過程を追究することにした。現在、合成した化合物(1)を大腸菌野生株VV3110株より調整した細胞膜成分に効率よく導入する方法を検討中である。

In the ペプチドグリカ <s:1> layer of bacterial cell walls, lipids are synthesized as <s:1> Lipid intermediates II に お け る オ リ ゴ sugar lock の コ ア construct the cytoplasm で が build さ れ, body sugar リ ピ ド, ウ ン デ カ プ レ ニ ル リ ン acid と し た も の が cells lining the lateral か ら outer membrane side へ "フ リ ッ プ - フ ロ ッ プ planning shift" さ れ て, cell surface で の ペ プ チ ド グ リ カ ン layer biosynthesis に supply さ れ る. こ の enzyme の state be を interpret す る た め に, わ れ わ れ は こ の process に masato and す る sugar temple body リ ピ ド, ウ ン デ カ プ レ ニ ル リ ン acid の 駆 body before を synthetic す る enzyme, ウ ン デ カ プ レ ニ ル ニ リ ン acid synthetase (UPS) を シ ス type プ レ ニ ル lock to extend the enzyme と し て early め て ク ロ ー ン し, そ の X-ray crystal structure analysis に success し て い る の で, UPS の large 発 now を using す る こ と で enzyme, mark "フ リ ッ パ ー ゼ" の line matrix synthesis を っ て の, bacteria cell wall biosynthesis に お け る not interpret な process の catalyst で あ る "フ リ ッ パ ー ゼ" の state be を interpret し, そ の molecular レ ベ ル で の interpret out の si mouth を see す こ と を の purpose this study と し た. First ず, UPS の large 発 now を using し have て た UPS を with い て ウ ン デ カ プ レ ニ ル ニ リ ン acid の large GeChengXi を establishing し, UDP - MurNAc - pentapeptide を Bacillus The <s:1> extraction of <s:1> from cereus <s:1> culture medium ら, the discovery of Phospho-MurNAc-pentapeptide transferase(MraY) <s:1> is を to construct <s:1> て, the synthesis of Lipid I <s:1> enzyme is established by ho を test みたが, and the <s:1> construction of で な な な った by mass synthesis is った. そ こ で, ウ ン デ カ プ レ ニ ル リ ン acid の リ ン acid radical に ア ミ ノ エ チ ル base が ジ エ ス テ ル combining し を た compounds synthesis し, こ の ア ミ ノ base に 蛍 発 light color 団 と し て NBD (7 - nitrobenz - 2 - oxa - 1, 3 - diazol - 4 - yl) base を import し た compounds (1) を synthetic し た. さ ら に (1) の プ レ ニ ル base を フ ァ ル ネ シ ル base, ま た は ゲ ラ ニ ル ゲ ラ ニ ル base に replacement し も た compounds synthesis し, ウ ン デ カ プ レ ニ ル リ が ン acid membrane の outer membrane か ら lining へ フ リ ッ プ - フ ロ ッ プ planning move に よ り back 収 さ れ す を る process investigated る こ と に し た. Now, synthetic し た compounds (1) を coliform wild seedlings よ VV3110 り adjustment し た membrane composition に sharper rate よ く import す る method を 検 beg in で あ る.

项目成果

N.Ohya, T.koyama: "Biopolymers, Volume 2, Polyisoprenoids Chapter 4. Biolsynthesis of Natural Rubber and Other Natural Polyisoprenoids"Wiley-VCH Verlag GmbH Weinheim. 37 (2001)

N.Ohya，T.koyama：“生物聚合物，第 2 卷，聚异戊二烯第 4 章。天然橡胶和其他天然聚异戊二烯的生物合成”Wiley-VCH Verlag GmbH Weinheim。

M.Fujjihashi, Y.-W.Zhang, Y.Higuchi, X.-Y.Li, T.Koyama, K.Miki: "Crystal Structure of cis-Prenyl Chain Elongating Enzyme, Undecaprenly Diphosphate Synthase"Proc. Natl. Acad. Sci., U. S. A.. 98. 4337-4342 (2001)

M.Fujjihashi、Y.-W.Zhang、Y.Higuchi、X.-Y.Li、T.Koyama、K.Miki：“顺式异戊烯基链延长酶、十一烯二磷酸合酶的晶体结构”Proc。

M.Nagaki, K.Kimura, H.Kimura, Y.Maki, E.Goto, T.Nishino, T.Koyama: "Artificial Substrates of Medium-Chain Elongation Enzymes, Hexaprenyl-and Heptaprenyl Diphosphate Synthases"Bioorg. Med, Chem. Lett.. 11. 2157-2159 (2001)

M.Nagaki、K.Kimura、H.Kimura、Y.Maki、E.Goto、T.Nishino、T.Koyama：“中链延伸酶、六戊二烯基和庚戊二烯基二磷酸合成酶的人工底物”Bioorg。

Y.-W.Zhang, T.Koyama: "Biopolymers, Volume 2, Polyisoprenoids Chapter 5. Biosynthesis Routes Diverting from Intermediates of Polyisoprenoid Biosynthesis to Related Products of the Metabolism"Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim. 40 (2001)

Y.-W.Zhang、T.Koyama：“生物聚合物，第 2 卷，类聚异戊二烯第 5 章。从类聚异戊二烯生物合成中间体转向代谢相关产物的生物合成路线”Wiley-VCH Verlag GmbH，Weinheim。

Y.Kharel, Y-W.Zhang, M.Fujihashi, K.Miki, T.Koyama: "Identification of Significant Residues for Homoallylic Substrate Binding of Micrococcus luteus B-P 26 Undecaprenyl Diphosphate Synthase"J. Biol. Chem.. 276. 28459-28464 (2001)

Y.Kharel、Y-W.Zhang、M.Fujihashi、K.Miki、T.Koyama：“藤黄微球菌 B-P 26 十一碳二烯基二磷酸合成酶同烯丙基底物结合的重要残基的鉴定”J。