糖タンパク質生合成におけるオリゴ糖鎖の小胞体膜間輸送機構の解明

阐明糖蛋白生物合成中寡糖链的内质网膜转运机制

• 批准号: 14037204
• 负责人: 古山 種俊
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14037204/
• 关键词: フリッパーゼ; フリップ-フロップ; ファルネシルニリン酸; ウンデカプレニル二リン酸; 糖タンパク質生合成; ドリコールリン酸; プレニルトランスフェラーゼ; ポリプレノール

真核生物の糖タンパク生合成において粗面小胞体の細胞質ゾル側で生合成されたコアオリゴ糖成分をフリップ-フロップ移送によりルーメン側に輸送する動的な過程に関与するとされ、教科書にも記述されているにもかかわらず、全く実体が把握されていない酵素「フリッパーゼ」の酵素活性測定法の確立のために、蛍光プローブの合成法を検討した。まず、ルーメン側でタンパク質にオリゴ糖を転移させた後の担体脂質の回収過程、すなわちドリコールのフリップ-フロップ現象をターゲットにしたプローブとして、蛍光ラベルしたポリプレノールの合成を行った。この蛍光性プローブを用いて、人工的に調製したリボソームの二重膜中でのフリップ-フロップ現象の定量的測定法の確立のための条件検討を行った結果、ジチオナイトによってリポソームの外膜側の蛍光を消光し、蛍光プローブ量の変化を定量化する簡便な測定法が確立できた。一方、細菌の細胞壁生合成において、細胞質側で生合成されたオリゴ糖鎖をフリップ-フロップ移送により細胞外膜側に輸送する動的な過程に関与するフリッパーゼの酵素活性測定法の確立のために、ウンデカプレニルリン酸の蛍光剤修飾体を合成し、大腸菌の内膜タンパク質を含有するリン脂質のリポソームを用いたウンデカプレニルリン酸のフリップ-フロップ転移活性の定量化を行う系が確立出来た。ヒトのデヒドロドリキルニリン酸合成酵素のcDNAをクローン化し、発現系の構築に成功した。これにより、ヒトの糖タンパク生合成のフリッパーゼ関連遺伝子の探索研究の手がかりを得ることが出来た。

Eukaryotic carbohydrate biosynthesis in the cytoplasm of rough microsomes and the establishment of enzyme activity assays for the determination of carbohydrate components in the cytoplasm of rough microsomes and the transfer of carbohydrate components in the cytoplasm of eukaryotic cells A new method of synthesis of light and oxygen The recovery process of carrier lipids after the change of sugar, the synthesis of carrier lipids and the phenomenon of carrier lipids after the change of sugar, the synthesis of carrier lipids after the change of sugar, the synthesis of carrier lipids and the synthesis of carrier lipids. The quantitative determination method of the optical property of the optical fiber in the double film was established by using the artificial modulation method. The results of the conditional analysis were discussed. The simple determination method for quantifying the optical property of the optical fiber on the outer film side was established. The enzyme activity assay was used to determine the synthesis of light modifiers of intracellular acid and glucose in the cell wall biosynthesis, cytoplasm-side biosynthesis, and extracellular membrane-side transport of bacteria. A quantitative study of the lipid metabolism of E. coli was established. Construction of a cDNA library for the development of a novel enzyme for the synthesis of amino acids The study of the relationship between sugar production and synthesis is carried out in the following ways:

项目成果

M.Nagaki, K.Kuwahara, K.Kimura, J.Kawakami, Y.Miki, S.Ito, N.Morita, T.Nishino, T.Koyama: "Substrate Specificities of Medium-Prenyichain Elongating Enzymes, Hexaprenyl-and Heptaprenyl Diphosphate Synthases"J. Mol. Catal. B : Enzymatic. (印刷中). (2003)

M.Nagaki、K.Kuwahara、K.Kimura、J.Kawakami、Y.Miki、S.Ito、N.Morita、T.Nishino、T.Koyama：“中异戊二烯链延长酶、六戊二烯基和庚戊二烯基的底物特异性二磷酸合成酶”J. Mol. Catal. B：酶学。（印刷中）。（2003 年）

Y.Kharel, T.Koyama: "Molecular Analysis of cis-Prenyl Chain Elongating Enzymes"Natural Product Reports. 20・1. 111-118 (2003)

Y.Kharel，T.Koyama：“顺式异戊二烯基链延长酶的分子分析”天然产物报告20・1（2003）。

S.Endo, Y.-W.Zhang, S.Takahashi, T.Koyama: "Identification of Human Dehydrodolichyl Diphosphate Synthase Gene"Biochim. Biophys. Acta.. 1625・3. 291-295 (2003)

S.Endo、Y.-W.Zhang、S.Takahashi、T.Koyama：“人脱氢多羟基化合物二磷酸合酶基因的鉴定”Biochim. Biophys. 1625・3 (2003)。

M.Nagaki, H.Yamamoto, A.Takahashi, Y.Maki, J.Ishibashi, T.Nishino, T.Koyama: "Substrate Specificity of Thermostable Farnesyl Diphosphate Synthase with Respect to 4-Alky Group Homologs of Isopentenyl Diphosphate"J. Mol. Cata. B : Enzymatic. 17-2. 81-89 (20

M.Nagaki、H.Yamamoto、A.Takahashi、Y.Maki、J.Ishibashi、T.Nishino、T.Koyama：“热稳定法尼基二磷酸合酶对异戊烯基二磷酸的 4-烷基同系物的底物特异性”J。

槙 雄二, 長岐正彦, 西野徳三, 古山種俊: "有機合成におけるイソプレノイド生合成関連酵素:酵素機能改変と炭素-炭素結合形成ツールとしての有用性と展望"有機合成化学協会誌. 60・8. 783-793 (2002)

Yuji Maki、Masahiko Nagagi、Tokuzo Nishino、Tanetoshi Furuyama：“有机合成中类异戊二烯生物合成相关酶：作为酶功能修饰和碳-碳键形成工具的用途和前景”有机合成化学学会杂志 60・8。 783-793 (2002)