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遺伝子工学的手法を用いたプロテアーゼインヒビターの機能構造の解明

利用基因工程方法阐明蛋白酶抑制剂的功能结构

基本信息

批准号：
05680531
负责人：
小島修一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Gakushuin University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

一般にプロテアーゼインヒビターの反応部位近傍の構造は阻害の相手となるプロテアーゼの基質類似構造をしているにもかかわらず、プロテアーゼと強固な複合体を形成し、プロテアーゼ活性を抑える。本研究ではプロテアーゼインヒビターがこのようなユニークな性質を示すための構造的基盤を明らかにするために、放線菌ズブチリシンインヒビター(SSI)を研究材料として用い、遺伝子工学の手法により部位特異的にアミノ酸置換を施し、SSIがプロテアーゼインヒビターとして機能するためにはどのようなアミノ酸あるいは構造的要素が必要であるか調べた。まず、SSIの反応部位近傍に存在するジスルフィド結合を取り除いたところ、ズブチリシンに対する阻害活性がインキュベーション時間の経過と共に低下するという一時阻害の現象を示すことがわかった。そしてこの現象は、ズブチリシンによって変異SSIの反応部位のペプチド結合が切断された中間体を経て分解が進行することであることが明らかになった。また変性温度も20度程低下していた。すなわち反応部位近傍のジスルフィド結合を取り除くとゆらぎが増大し、そのためプロテアーゼによって切断されたペプチド結合が再生されないことが一時阻害の原因であると結論された。反応部位近傍のジスルフィド結合はそのまわりの構造的ゆらぎを抑えることにより、SSIがインヒビターとして機能するために必要な構造なのである。一方反応部位のN末端側に存在するフレキシブルループから2残基を欠失させるとやはり一時阻害を示すようになったが、この場合は反応部材に歪みがかかったことが原因であると考えられた。さらに反応部位から離れ、C末端のカルボキシル基と塩結合しているArg29を置換した場合も一時阻害を示すようになった。この場合は、変異により、プロテアーゼによる非特異的な分解を受け得る変性状態への平衡がずれたためであると考えられた。

Generally, the structure of the reaction area near the reaction area and the obstruction of the hand are similar to the base of the base. Constructed をしているにもかかわらず, プロテアーゼとStrong な Complex を Formation し, プロテアーゼActive をSuppressed る. This research is based on the nature of the ではプロテアーゼインヒビターがこのようなユニークな Shown of the すための structureを明らかにするために、Actinobacteria ズブチリシンインヒビター(SSI)をResearch Materialsとしてい、 The technique of the work of the ottoman is the part-specific acid substitution technique and the SSI technique.ターとして Function するためにはどのようなアミノ sour あるいは The elements of the structure がNecessary であるか Adjustment べた.まず、SSIのreflexion site close to the existence するジスルフィドcombinationをtakeりりいたところ、ズブチリシンに対するInhibition activity is a phenomenon that is temporarily inhibited when the time passes and the total is low.そしてこのphenomenonは、ズブチリシンによって変different SSIののペプチド knot The combination and cutting of the intermediates and the decomposition of the intermediates are carried out and carried out. The temperature is lower than 20 degrees Celsius.すなわちThe reaction area is close to the のジスルフィドcombinationをtakeり出くとゆらぎが嗗大し、そのためプロテアーゼによって Cut off されたペプチド Combine がRegeneration されないことが Temporary hindrance のCause であると Conclusion された. The reaction area is close to the のジスルフィド combined with the はそのまわりの structure of the ゆらぎを氪ることにより, SSI がインヒビターとして Function するためにNecessary Structure なのである. The N-terminal side of the reaction site exists and the two residues are missing. Harmful show すようになったが, このoccasion は revolt part material にskew みがかかったことがreason であると考えられた. The さらににににらisolation and the C-terminal のカルボキシルbase と塩 bonding しているArg29を replacement した occasion is a temporary hindrance をshow すようになった. non-specific decompositionをReceived る変性state へのbalance がずれたためであると考えられた.