蛋白工学的手法による亜硝酸還元系を構成する銅蛋白間の相互作用様式の解析

利用蛋白质工程方法分析构成亚硝酸盐还原系统的铜蛋白之间的相互作用模式

• 批准号: 07660098
• 负责人: 西山 真
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07660098/
• 关键词: 亜硝酸還元酵素; 電子伝達; 蛋白質相互作用

我々はAlcaligenes faecalisS-6株において、脱窒の一過程である亜硝酸還元を担う銅含有亜硝酸還元酵素(NIR)及び同酵素への直接の電子伝達物質として同菌より単離された青色銅蛋白質シュードアズリン(PA)の間の電子伝達機構についての解析を行ってきた。我々は、両銅蛋白質間の電子伝達機構を解明するための基礎となる両蛋白質間の相互作用様式を解明するために、PA分子表面に存在するリジン残基の改変体を作製し、それらのNIRに対する親和性を調べることによって、PAが自身の銅原子近傍に存在するリジン残基を介してNIRと相互作用することを明らかにしてきた。そこで、本研究ではNIRの分子表面にある種々の酸性残基を改変し、PAとの相互作用の変化を調べることとした。これまでの我々の研究により、NIRに含まれる2種類の銅原子のうちタイプ1銅がPAから電子を受け取り、タイプ2銅へ電子を受け渡すことが明らかとなっているが、その結果と一致するように、タイプ1銅近傍に存在する酸性アミノ酸残基の改変により、PAとの相互作用が低下することが明らかとなった。これらの結果は、両銅蛋白質の相互作用には静電的相互作用が関与することを示唆している。そこで、様々な組み合わせで各改変体間の電子伝達を調べた結果、NIRのE197とPAのK10間、NIRのGlu118とPAのK57/K77間に相互作用が存在していることが明らかとなった。

我们已经分析了含铜的亚硝酸盐还原酶（NIR）之间的电子转移机制，该机制负责亚硝酸盐还原的反硝化过程，而蓝色铜蛋白假硫蛋白（PA）则是从细菌中分离出的直接电子传递剂，它们是从细菌中分离出来的。为了阐明两种蛋白质之间的相互作用模式，这是阐明两种铜蛋白之间电子转移机制的基础，我们创建了存在于PA分子表面上的赖氨酸残基的变体，并研究了其对NIR的亲和力，并揭示了PA通过位于其自身铜的赖赛残基与NIR与NIR相互作用。因此，在这项研究中，我们决定修改NIR分子表面上的各种酸性残基，以研究与PA相互作用的变化。我们以前的研究表明，在NIR中包含的两种类型的铜原子中，1型铜从PA接收电子，并将电子传递到2型铜。然而，与结果一致，已经表明，在1型铜的附近存在酸性氨基酸残基的改变会减少与PA的相互作用。这些结果表明，静电相互作用涉及两种铜蛋白的相互作用。因此，我们研究了各种组合中的变体之间的电子传递，发现NIR中的E197与PA中的K10以及NIR中的GLU118与PA中的K57/K77之间存在相互作用。

项目成果

Murphy,M.E.P.: "Structure of Alcalingenes faecalis nitrite reductase and a copper site mutant,M150E,that contains zinc." Biochemistry. 34. 12107-12117 (1995)

墨菲，M.E.P.：“粪产碱菌亚硝酸盐还原酶的结构和含锌的铜位点突变体 M150E。”

Kukimoto,M.: "Identification of interaction site of pseudoazurin with it redox partner,copper-containing nitrite reductase from Alcaligenes faecalis S-6" Protein Engineering. 8. 153-158 (1995)

Kukimoto,M.：“鉴定假天青与其氧化还原伙伴、来自粪产碱菌 S-6 的含铜亚硝酸还原酶的相互作用位点”蛋白质工程。