耐熱性リンゴ酸脱水素酵素の安定性及び折れたたみ機構に関する研究

耐热苹果酸脱氢酶稳定性及折叠机制研究

• 批准号: 07280201
• 负责人: 西山 真
• 金额: $ 1.6万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07280201/
• 关键词: リンゴ酸脱水素酵素; 耐熱性酵素; 蛋白質リフォールディング

我々は、これまで高度好熱性細菌Thermus flavusの有する耐熱性リンゴ酸脱水素酵素(tMDH)の耐熱性や、高温下に反応至適を示す好熱性メカニズムについて研究を行ってきた。野性型tMDHは高い安定性を示すと同時に、塩酸グアニジン変性に対しても完全に可逆的に再生され、そのフォールディング機構の解析は、tMDHの高い安定性を理解する上で重要な知見を与えるものと考えられた。そこで本研究では、本酵素をドメイン或いはさらに小さなフラグメントに遺伝子工学的に分断して、そこから再構成されるtMDHの安定性やリフォールディング能について調べることで、蛋白質の折りたたみ機構を解析することとした。NAD結合ドメインと触媒ドメインの2つのドメインから成り立つ本酵素を、ほぼ各ドメイン部分に相当する領域の遺伝子ごとに分断して独立に発現することにより、野性型酵素と完全に同等の活性を有する耐熱性MDHが再構成されることを見いだした。また一方で、この独立したドメインで構成されるtMDH及び各ドメインが、塩酸グアニジン変性に対してどのような再生効率を示すかを調べたところ、再生効率は野性型酵素と比べて大幅に小さく、さらに濃度依存性を示したことから、各ドメインが、協調的にフォールディングする可能性が考えられた。SDS-PAGEからの回収により、各ドメインを分離し、それぞれのドメインを用いた折りたたみ実験を行った結果、やはり再生の協調性がみられたことから、各ドメインが自立的にフォールディングするわけではない可能性が示唆された。現在正確に各ドメインに分断したフラグメント酵素を作製中であり、フォールディングの協調性についての詳細な解析を進行中である。

我们先前已经研究了高度嗜热细菌热黄素的热耐热苹果酸脱氢酶（TMDH）的耐热性，以及在高温下显示最佳反应的嗜热机制。野生型TMDH表现出很高的稳定性，并且对圭亚捷盐酸盐的变性完全可逆，并且对其折叠机制的分析被认为可以为理解TMDH的高稳定性提供重要的见解。因此，在这项研究中，我们通过将酶锻炼到结构域甚至较小的片段，研究TMDH重新构成的稳定性和重新折叠能力，从而分析了蛋白质的折叠机制。通过将和表达该酶由两个结构域组成，即NAD结合结构域和催化结构域组成，将其分成几乎与每个域部分相对应的区域中的每个基因，发现热耐药的MDH具有完全等于野生型Enzyme的活性。另一方面，当我们研究TMDH和每个域的再生效率（由这些独立域组成，针对盐酸盐酸盐酸盐的变性而组成）时，再生效率明显小于野生型酶的再生效率，而野生型酶的再生效率则依赖于野生型浓度，并且表明每个domain都可以折叠在soerain中。从SDS-PAGE中检索揭示了每个域和使用每个域的折叠实验，因此还观察到了再生配位，表明每个域可能无法独立折叠。当前，正在准确地生产碎片酶分为每个域，目前正在进行折叠协调的详细分析。