ドメインに分断されたリンゴ酸脱水素酵素を用いた折れたたみ機構に関する研究

苹果酸脱氢酶分域折叠机制研究

• 批准号: 08272204
• 负责人: 西山 真
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08272204/
• 关键词: リンゴ酸脱水素酵素酵素; 耐熱性酵素; フォールディング; 蛋白質工学

野生型tMDHは90℃の熱処理によっても失活しない高い耐熱性を有する。tMDHはNAD結合ドメインと触媒ドメインの大きく2つの機能ドメインから成り立つが、このドメインのフォールディングおよびそれらのフォールディングにおける相互作用を解析することにより、個々の蛋白質ドメインのフォールディングと蛋白質全体のフォールディングとの関係が明らかになると同時に、tMDHの高い安定性を理解するための重要な知見が得られるものと期待された。tMDHを完全にドメインごとに分断された酵素蛋白質を作製したところ、野生型酵素とほとんど同一の酵素活性を有することが明らかとなった。この分断tMDHは若干耐熱性が低下したものの、依然として80℃でも失活しない高い耐熱性を有していた。また、各ドメインを独立に大腸菌内で生産させたところN末ドメインのみが安定に大腸菌金体内に可溶性蛋白として生産された。このことから、少なくともN末のNAD結合ドメインが独立にフォールディング能を持ち、それを核としてC末ドメインがフォールディングする可能性が示唆された。つぎに分断酵素の塩酸グアニジンを用いた変性-再生の解析を行った。両過程においても興味深いことに、同一変性剤濃度において再生時の方が変性時よりも高い二次構造含量を持っていることが明らかとなった。また、変性においては蛋白質濃度依存性が見られなかったが、再生時は再生の最終段階で濃度依存の相が見られた。これらの事実は、この分断酵素が変性と再生の経路が異なる可能性を示唆しているものと考えられた。一方、tMDHの個々のサブユニットの安定性とドメイン間相互作用との関係を調べるため、ドメイン間相互作用に関与すると考えられるアミノ酸残基を改変したが、その改変体の耐熱性には全く低下が認められなかった。tMDHとブタ細胞質型MDHでアミノ酸配列を比較した場合、両者間では50%ものアミノ酸が同一であるにもかかわらず、安定性は著しく異なっている。これまでの研究により、tMDHにおいてはサブユニット間の結合が非常に強固であり、これが分子全体の安定性を増大させるのに寄与していることが示唆されていた。そこで、tMDHにのみ見られる塩橋に注目し、構成するアミノ酸に置換して、安定性ならびにリフォールディングへの影響について解析したところ、この改変体は耐熱性、塩酸グアニジン耐性に変化が見いだされなかったが、SDSに対する耐性が著しく低下していることが明らかとなった。

Wild-type tMDH is inactivated by heat treatment at 90 ℃ and has high heat resistance. tMDH binds to NAD and catalyzes the interaction between protein and protein. tMDH binds to NAD and catalyzes the interaction between protein and protein. tMDH's high stability is understood by the important knowledge gained and expected. tMDH enzyme activity The thermal stability of the TMDH is low, but it is still inactive at 80 ℃. The production of soluble proteins in Escherichia coli is independent of each other. The possibility of a combination of these two elements is demonstrated by the fact that the two elements are independent and that the two elements are independent. The analysis of enzyme activity and enzyme activity in the process of regeneration. In the process, the content of the secondary structure is high, and the content of the secondary structure is high. The protein concentration dependence of the regeneration phase was observed. This is the first time that the enzyme has changed its nature and the pathway of regeneration has changed. The stability and interaction between the two components of tMDH were modified by the modification of acid residues. tMDH and cytoplasmic MDH are different in acid alignment, stability, and 50% in acid alignment. This study is very strong, and the stability of the molecule as a whole is increasing. In addition, tMDH has been found to be resistant to heat, acid and SDS.

项目成果

M.Nishiyama: "Enhancement of the turnover number of thermostable malate dehydrogenase by deleting hydrogenbonds around the catalytic site" Biochem.Biophys.Res.Commun. 225. 844-848 (1996)

M.Nishiyama：“通过删除催化位点周围的氢键来提高热稳定苹果酸脱氢酶的周转数”Biochem.Biophys.Res.Commun。