蛋白工学を用いた銅蛋白間の電子伝達機構の解析

利用蛋白质工程分析铜蛋白之间的电子传递机制

• 批准号: 05660086
• 负责人: 西山 真
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05660086/
• 关键词: 亜硝酸還元酵素; 蛋白工学; 部位特異的変異; 脱窒; 電子伝達; 銅蛋白

活性汚泥から単離した脱窒菌Alcaligenes faecalis S-6株において、同菌の脱窒の一過程を担う亜硝酸還元系は、亜硝酸還元酵素(NIR)およびシュードアズリンという二つの銅蛋白によって構成されている。同様な銅蛋白による亜硝酸還元系は後になって微生物からカビにわたって広く分布することが明かとなってきた。しかしながら今までに蛋白の銅配位環境と蛋白としての機能の関係、さらには二つの銅蛋白の銅原子間でどのように受け渡しされるのかについては全く明らかになっていなかった。本研究では蛋白工学的に蛋白を改変しそれらの性質を調べることで銅蛋白の構造と機能および銅蛋白間の電子伝達機構を明らかにすることとした。まず、そのための前段階として大腸菌でのNIR遺伝子の発現の最適化を行った。その結果、改変した分泌シグナルをNIR遺伝子に連結し、lacプロモーターの制御下、25-30・Cの低温で培養することにより、1リッター当たり3mg程度のNIRを大腸菌ペリプラズムに分泌する系を確立することに成功した。この系を用いて、NIRがサブユニット当たり1原子ずつ保持しているタイプI銅、タイプII銅の銅原子配位座(リガンド)のうち、タイプI銅リガンドのMet150をGluに、タイプII銅リガンドのHis135をLysに改変した酵素を作製、精製した。Met150Glu改変体は予想どおりタイプI銅を欠失していたが、His135Lys改変体はタイプIIリガンドのうちの1つが変化しているにも関わらず、タイプI、タイプIIの両方の銅を結合していることが明らかになった。次に、これらの改変体の活性を低分子のメチルビオロジェンを電子供与体として用いて測定したところ、His135Lysでは全く活性が検出されない一方、Met150Glu改変体では、十分な亜硝酸還元活性が検出された。これらの結果から、NIRにおいてはタイプII銅が活性に直接的に関わることがはじめて直接的に明らかになった。また、シュードアズリンの銅の周辺に位置するLys残基を中性または酸性残基に変換したところ、Lys10およびLys38の改変により、NIRへの電子伝達能が大きく低下することが明らかになりつつあり、シュードアズリンの銅原子周辺が、NIRと直接的に相互作用していることが示唆された。現在、NIRに含まれるタイプI銅の役割および、シュードアズリンのLys改変体を用いた、NIRとシュードアズリンの相互作用様式の解析を進めている。

The activated sludge is isolated and degassed by Alcaligenes faecalis S-6 strain, and the same bacteria are degassed by nitrate reduction system, nitrate reduction enzyme (NIR) and copper protein. The same is true for copper nitrate reduction systems. The relationship between the copper coordination environment of protein and the function of protein, the transition between copper atoms of protein and copper atoms, the transition between copper atoms and copper atoms. This study aims to clarify the structure, function and electronic mechanism of protein engineering. Optimization of NIR gene production in Escherichia coli As a result, the NIR secretion system was successfully established under the control of lac secretion system at 25-30 ℃. This is the preparation and purification of enzymes for the conversion of Met150 to Glu and Met 135 to Lys in the copper atom coordination site (s) of Cu, Cu and Cu (II). Met150Glu modified body is intended to be used for the combination of copper with copper in the form of copper and copper in the form of copper. In addition, the activity of the modified product was determined by electron donor method. The activity of His135Lys was determined by electron donor method. The activity of Met150Glu was determined by electron donor method. The result of this is that the NIR is not active. Lys residues in the copper atoms at the peripheral position of the copper atom are neutral and acidic residues are changed to Lys10 and Lys38. The electron transfer energy of the NIR atom is greatly reduced. Now, NIR includes the analysis of the interaction model of copper, copper,

项目成果

M.Nishiyama: "Cloning and characterization of a nitrite reductase gene from Alcaligenes faecalis and its expression in Escherichia coli" Journal of General Microbiology. 139. 725-733 (1993)

M.Nishiyama：“粪产碱菌亚硝酸还原酶基因的克隆和表征及其在大肠杆菌中的表达”普通微生物学杂志。