精密な立体構造に基づく2つの銅蛋白質の相互作用様式の解析

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両銅蛋白質、亜硝酸還元酵素およびシュードアズリンは、A.faecalis S-6の脱窒の一過程である亜硝酸還元系を構成する電子伝達蛋白質である。シュードアズリンは等電点をアルカリ域に有する蛋白質で、分子表面に多数のリジン残基が存在している。これらリジン残基をアラニンまたはアスパラギン酸に置換した改変を作製し、それぞれの改変体の亜硝酸還元酵素に対する親和性を調べることによって、シュードアズリンが有するタイプ1銅周辺に位置するリジン残基改変により亜硝酸還元酵素に対する親和性が著しく低下することを見いだされ、シュードアズリンがタイプ1銅近傍のリジン残基を介して亜硝酸還元酵素と静電的に相互作用している可能性を強く示唆されていた。また、先の研究により亜硝酸還元酵素のタイプ1銅がシュードアズリンから電子を受け取り、活性中心であるタイプ2銅へと電子を渡す役割を有することが明らかになっていたことから、本研究計画では亜硝酸還元酵素のタイプ1銅近傍に存在する酸性アミノ酸残基を中心とした改変を行い、シュードアズリンとの相互作用に関わる5つの酸性アミノ酸残基を特定した。つぎに、両蛋白質間の相互作用には関わっているが互いに直接には相互作用していない残基を両方とも改変した場合には、両蛋白質の親和性は相乗的に著しく低下するが、直接相互作用している残基同士を改変した場合にはその影響は比較的少ないものと予想された。この原理に則り、先の研究で既に取得してある亜硝酸還元酵素との親和性が低下した種々のシュードアズリンの改変体と5つのシュードアズリンとの相互作用が低下した亜硝酸還元酵素の改変体を様々に組み合わせて両蛋白質間の電子伝達能を調べた結果、亜硝酸還元酵素及びシュードアズリンの互いに相互作用しているアミノ酸残基のペアを少なくとも2つ同定した。