銅蛋白間の電子伝達機構に関する蛋白工学的研究

铜蛋白间电子传递机制的蛋白质工程研究

• 批准号: 06660090
• 负责人: 西山 真
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1994
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1994 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-06660090/
• 关键词: 電子伝達; 部位特異的変異; 銅蛋白質; 蛋白質間相互作用

我々は脱窒菌Alcaligenes faecalisS-6株の亜硝酸還元酵素への電子伝達物質として同菌より青色同蛋白質シュードアズリンを発見し、銅蛋白間での電子伝達を世界で初めて示すと共に、これら銅蛋白間の電子伝達機構についての解析を行ってきた。本研究では、亜硝酸還元酵素が保持する2種類の銅原子の中で、タイプ1銅配位子の改変体Met150Glu、タイプ2銅配位子の改変体His135Lysに対して、シュードアズリンおよびメチルビオロジェンを電子供与体として速度論的解析を行った。メチルビオロジェンを用いた場合、Met150Gluでは酵素活性が検討されたが、His135Lysでは活性が全く検出されず、タイプ2銅が活性に関与することが明らかになった。さらに、シュードアズリンを用いた場合には、Met150Gluのシュードアズリンに対する見かけの親和性にはほとんど変化が観察されないものの、電子伝達活性は1/1000に大幅に低下していた。これらの事実から、亜硝酸還元酵素のタイプ1銅がシュードアズリンから電子を受け取り、タイプ1銅から電子を渡されたタイプ2銅が活性に関与することが明らかなった。シュードアズリンの銅原子の周囲の分子表面に多数のLys残基が存在しており、これらのアミノ酸残基が亜硝酸還元酵素との相互作用を担うことが示唆された。そこで、シュードアズリンの9個のLys残基を1つずつAlaまたはAsp残基に置換して、亜硝酸還元酵素との相互作用を調べたところ、との改変体も亜硝酸還元酵素への電子伝達活性には影響を与えなかったが、タイプ1銅に近い変異のみが親和性を大きく低下させることが明らかになった。これらの結果から、シュードアズリンは自身の銅原子を亜硝酸還元酵素に向けて、Lys残基を介した静電的相互作用により亜硝酸還元酵素と相互作用していることが示された。

The electron transfer mechanism of nitrate reducing enzyme from strain Alcaligenes faecalis S-6 was first demonstrated in the world, and the electron transfer mechanism between copper proteins was analyzed. In this study, the electron donor and the rate-theoretic analysis of the nitrate reducing enzyme were carried out for the two kinds of copper atoms, Met150Glu and His135Lys, respectively. When the enzyme activity of Met150Glu is detected, the enzyme activity of His135Lys is detected, and the enzyme activity of Met 150 Glu is detected. In the case of Met150 Glu, the affinity of Met150 Glu was 1/1000 lower than that of Met150 Glu. The activity of nitrate reducing enzyme is closely related to the activity of copper. Most of the Lys residues on the surface of the molecule of copper atoms are present, and the interaction between the acid residues and nitrate reducing enzymes is important. The 9 Lys residues in the protein were replaced by Ala residues, and the interaction of nitrate reductase was modulated. The electron transfer activity of nitrate reductase was affected by the affinity of 1 copper residue. As a result, the copper atom in the enzyme is present, and the Lys residue is present in the enzyme.

项目成果

Mutsuko Kukimoto: "X-ray structure and site-directed mutagenesis of a nitrite reductase from Alcaligenes faecalis S-6:roles of two copper atoms in nitrite reduction" Biochemistry. 33. 5246-5252 (1994)

Mutsuko Kukimoto：“来自粪产碱杆菌 S-6 的亚硝酸盐还原酶的 X 射线结构和定点诱变：两个铜原子在亚硝酸盐还原中的作用”生物化学。