ドメインに分断されたリンゴ酸脱水素酵素を用いた折れたたみ機構に関する研究

苹果酸脱氢酶分域折叠机制研究

• 批准号: 08272204
• 负责人: 西山 真
• 金额: $ 1.09万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08272204/
• 关键词: リンゴ酸脱水素酵素酵素; 耐熱性酵素; フォールディング; 蛋白質工学

野生型tMDHは90℃の熱処理によっても失活しない高い耐熱性を有する。tMDHはNAD結合ドメインと触媒ドメインの大きく2つの機能ドメインから成り立つが、このドメインのフォールディングおよびそれらのフォールディングにおける相互作用を解析することにより、個々の蛋白質ドメインのフォールディングと蛋白質全体のフォールディングとの関係が明らかになると同時に、tMDHの高い安定性を理解するための重要な知見が得られるものと期待された。tMDHを完全にドメインごとに分断された酵素蛋白質を作製したところ、野生型酵素とほとんど同一の酵素活性を有することが明らかとなった。この分断tMDHは若干耐熱性が低下したものの、依然として80℃でも失活しない高い耐熱性を有していた。また、各ドメインを独立に大腸菌内で生産させたところN末ドメインのみが安定に大腸菌金体内に可溶性蛋白として生産された。このことから、少なくともN末のNAD結合ドメインが独立にフォールディング能を持ち、それを核としてC末ドメインがフォールディングする可能性が示唆された。つぎに分断酵素の塩酸グアニジンを用いた変性-再生の解析を行った。両過程においても興味深いことに、同一変性剤濃度において再生時の方が変性時よりも高い二次構造含量を持っていることが明らかとなった。また、変性においては蛋白質濃度依存性が見られなかったが、再生時は再生の最終段階で濃度依存の相が見られた。これらの事実は、この分断酵素が変性と再生の経路が異なる可能性を示唆しているものと考えられた。一方、tMDHの個々のサブユニットの安定性とドメイン間相互作用との関係を調べるため、ドメイン間相互作用に関与すると考えられるアミノ酸残基を改変したが、その改変体の耐熱性には全く低下が認められなかった。tMDHとブタ細胞質型MDHでアミノ酸配列を比較した場合、両者間では50%ものアミノ酸が同一であるにもかかわらず、安定性は著しく異なっている。これまでの研究により、tMDHにおいてはサブユニット間の結合が非常に強固であり、これが分子全体の安定性を増大させるのに寄与していることが示唆されていた。そこで、tMDHにのみ見られる塩橋に注目し、構成するアミノ酸に置換して、安定性ならびにリフォールディングへの影響について解析したところ、この改変体は耐熱性、塩酸グアニジン耐性に変化が見いだされなかったが、SDSに対する耐性が著しく低下していることが明らかとなった。

野生型TMDH具有较高的耐热性，即使在90°C的热处理时也不会停用。 TMDH由两个大功能域组成，即NAD结合域和催化域。通过分析该结构域的折叠以及这些结构域中的相互作用，可以揭示单个蛋白质结构域的折叠与整个蛋白质折叠之间的关系，同时还提供了重要的见解来了解TMDH的高稳定性。当TMDH完全分为结构域时，发现它具有与野生型酶几乎相同的酶活性。尽管该分隔的TMDH的耐热性略有降低，但它仍然具有高耐热性，即使在80°C下也不会停用。此外，每个结构域都是在大肠杆菌中独立生产的，只有N末端结构域稳定地作为大肠杆菌黄金中的可溶性蛋白质生产。这表明至少N末端NAD结合结构域具有独立的折叠能力，并且C末端结构域可以用它作为核折叠。接下来，使用盐酸鸟定酶进行变性和再生分析。有趣的是，这两个过程还揭示了在相同浓度的修饰符下，再生时的二级结构含量高于变性时的二级结构含量。此外，在变性中未观察到蛋白质浓度依赖性，但是在再生过程中再生的最后阶段中观察到浓度依赖性。这些事实表明，这种破坏性酶可能具有不同的变性和再生途径。另一方面，为了研究TMDH单个亚基与域间相互作用的稳定性，被认为与域间相互作用有关的氨基酸残基进行了修改，但没有观察到该变体的耐热性降低。当比较TMDH和猪细胞质MDH之间的氨基酸序列时，尽管它们之间存在相同的50％氨基酸，但稳定性显着差异。先前的研究表明，TMDH中亚基之间的键非常牢固，这有助于提高整体分子稳定性。因此，我们专注于仅在TMDH中发现的盐桥，并通过取代组成型氨基酸来分析对重折叠的稳定性和影响，并发现尽管在该变量的耐热性或盐酸盐酸耐药性中未发现任何变化，但发现对SDS的抵抗力显着降低了。

项目成果

M.Nishiyama: "Enhancement of the turnover number of thermostable malate dehydrogenase by deleting hydrogenbonds around the catalytic site" Biochem.Biophys.Res.Commun. 225. 844-848 (1996)

M.Nishiyama：“通过删除催化位点周围的氢键来提高热稳定苹果酸脱氢酶的周转数”Biochem.Biophys.Res.Commun。