筋細胞壊死におけるCa^<2+>依存性機構の解明

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(1)Ca^<2+>蛍光指示薬Fura-2を用い、骨格筋細胞培養系ラツト筋芽細胞L6における横紋筋壊死を誘発する薬剤(クロフィブラート、フロセミド、アンフォテリシンB、HMG-CoA還元酵素阻害剤など)を添加し、細胞内Ca2+濃度に対する効果を調べた。その際、膜電位依存性Caチャンネル、IP3_3作動性Caチャンネル、ライアノジンレセプター等の関与について各種ブロッカーを用い、薬理学的解析を行った。細胞内蛍光-Ca2+濃度の測定はHamamatsu Argas50画像解析システムで行い、光磁気ディスクに記録したデータの解析を行った。(2)この実験系において、細胞内Ca^<2+>結合蛋白(カルモジュリン、カルシニューリン)に対する抗体を用いて、その機能阻害を誘導することによりこれらの結合蛋白の役割について生理学的検討を行った。また、これらの蛋白のcDNAに対するプライマーを用いたmRNAの解析、ウェスタンブロット法による蛋白発現の解析を行い、薬剤の効果を検討した。(3)この実験系を用い、電顕による形態学的検討を行い障害される細胞内器官を同定した。また上記の抗体を用いてimmuno goldによる免疫電顕を施行した。(4)H^+蛍光指示薬BCECFを用いて細胞内pHを測定することにより薬剤の効果を調べ、細胞壊死との関連を検討した。(5)放射性同位元素(^<35>Cl等)による取り込み実験や、さらには細胞内Cl^-蛍光指示薬SPQを使用し、これらの薬剤のCl^-チャンネルに対する影響も併せて検討した。(5)筋萎縮性疾患(特にデュシャンヌ型筋ジストロフィー疾患者)、mdxマウスの培養筋芽細胞を用い、同様の実験系による細胞内Ca2+濃度、或いはCa^<2+>チャンネルの役割について検討を行った。