血管内皮細胞におけるトロンボモジュリン遺伝子の発現制御の研究

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トロンボモジュリン(thrombomodulin.TM)遺伝子はエンドトキシン、組織壊死因子(tumor necrosis factor,TNF)やインターロイキン-1β(interleukin-1β,IL-1β)により発現が抑制され、ホルボールエステル、ヒスタミン、cAMPやレチノイン酸で発現が増強する。今回、レチノイン酸の、TMの発現制御に与える作用について、遺伝子レベルで検討した。TM遺伝子の上流約2kb(キロ塩基)までを含むフラグメント(+145〜-2154)を用いて、制限酵素やBal31にて消化して様々な大きさのフラグメントを得た。これらの各フラグメントを、ルシフェラーゼ(luciferase,LUC)遺伝子をレポーター遺伝子としてもつベクター(pLUC)の上流に挿入して、様々な欠失コンストラクトを作製した。これらの各コンストラクトについてはシークエンスをおこなって5′端部位を決めた。レチノイン酸に反応するエレメントと類似する領域(RARE)が-400にみられ、この領域と同じ塩基配列をもつ、30bpのオリゴヌクレオチド(1RARE)と、繰り返しもつ、60bpのオリゴヌクレオチド(2RARE)を合成した。これらの合成オリゴヌクレオチドはプロモーター(SV40)をもつベクターpGL2promoterに挿入した。トランスフェクションは株化されたヒト臍帯静脈内皮細胞(ECV340)にリポフェクチンによる方法で行った。オールトランスレチノイン酸(all-trans retinoic acid,ATRA)の添加実験はトランスフェクション後24時間経過してから添加して、その後さらに24時間培養を続けるようにした。細胞抽出液はルシフェラーゼアッセイに用いた。その結果、1RAREと2RAREのコンストラクトともに10^8-10^6Mの濃度で、濃度依存性に反応性が確認された。ATRAの他に、各種合成レチノイド(Am80など)の効果についても、更に検討していきたい。