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カブトガニ血球の貯蔵顆粒内タンパク質のプロセシングと貯蔵顆粒の形成機構

鲎血细胞储存颗粒中蛋白质的加工及储存颗粒的形成机制

基本信息

批准号：
07680693
负责人：
川畑俊一郎
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1995
资助国家：
日本
起止时间：
1995 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07680693/
关键词：
Kex2 Subtilisin Furin

项目摘要

カブトガニの血球細胞には密度の異なる大小2種類の分泌顆粒が存在し、その中に体液凝固因子や抗菌物質などが多数含まれている。これらのタンパク質のうち、R-X-R-RもしくはR-X-K-Rの部位でプロセシングを受けて成熟型に変換されるものが少なくとも5種類見い出されており、Kex-2-likeプロテアーゼの存在が示唆された。今回、日本産カブトガニ血球由来Kex-2-likeプロテアーゼの全構造を明らかにする目的で、cDNAクローニングを行った。既知のKex-2-likeプロテアーゼ間で高く保存されている領域をもとにPCR法でプローブを作成し、血球cDNAライブラリーを用いてスクリーニングを行い、約2.5kbpのクローンについて塩基配列を決定した。その結果、全長は2557bpであり、752アミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていた(limulus subtilisin-related proprotein convertase ; L-SPCと命名)。L-SPCはKex-2-likeプロテアーゼ特有のサチライシン様触媒領域を有し、ショウジョウバエfurinの触媒領域と最も高いホモロジー(80%)を示した。しかし、L-SPC分子は、furinのC末端側に存在するCys-rich領域は無く、かわりにKex 2に見られるSer/Thr-rich領域が存在した。また、Kex 2やfurinに特有の膜貫通領域と考えられる領域がC末端側に見い出されたが、cytoplasmic tailと予想される領域は無く、その細胞内局在性に興味が持たれた。また、血球、心臓、肝膵臓、胃、腸、骨格筋のpoly A^<(+)> RNAを用いて、Northern blottingを行った結果、L-SPCは血球で特異的に発現していることが明らかになった。このことから、L-SPCが血球顆粒内タンパク質をプロセシングしている可能性が示唆された。次に、L-SPCのN末端側42アミノ酸残基(成熟タンパク質の1-42)とC末端側69アミノ酸残基(545-613)を、それぞれGST融合型でE. coliを用いて発現させ、それらを抗原としてポリクローナル抗体を作成した。得られた抗体は、COS細胞を用いて発現させたフルレングスのL-SPCに対しても反応性が得られた。そこで、この抗体を用いてL-SPCを発現しているCOS細胞を免疫沈降し、Western blottingを行ったところ、L-SPCは還元状態で分子量約110,000の糖タンパク質であることが明らかになった。また、同様の細胞を用いて免疫蛍光染色を行った結果、L-SPCはゴルジ体に局在することが明らかになった。

There are two kinds of secretory particles in different densities of blood cells, and most of them contain coagulation factors and antibacterial substances. The five species of Kex-2-like protein are identified by the presence of Kex-2-like protein. The origin of Kex-2-like protein is the whole structure of Kex-2-like protein. The Kex-2-like gene was prepared by PCR and the cDNA sequence of the Kex-2-like gene was determined by PCR. The results showed that the total length was 2557bp, 752 bp, and the amino acid residues were changed from limulus subtilis to related protein converter (L-SPC). L-SPC has the highest concentration of Kex-2-like active ingredients in the catalyst field (80%). Cys-rich domain exists on the C-terminal side of L-SPC molecule, and Ser/Thr-rich domain exists on the C-terminal side of L-SPC molecule. In addition, the unique membrane-penetrating and experimental fields of Kex2 and furin are visible on the C-terminal side, the cytoplasmic tail and imaginary fields are absent, and the intracellular localization is of great interest. PolyA ^<(+)> RNA in blood cells, heart, liver, stomach, intestine, and skeletal muscle was detected by Northern blotting and L-SPC was detected by hemocyte-specific RNA. The possibility that L-SPC can be used to change the quality of blood cell granules is discussed. N-terminal 42-amino acid residues (mature protein 1-42) and C-terminal 69-amino acid residues (545-613) of L-SPC are also included. coli is used to produce antigen-specific antibodies. The antibody was detected in COS cells, and the L-SPC cells were detected in COS cells. L-SPC antibody is produced in COS cells, and its molecular weight is about 110,000. The same cells were stained with immunofluorescence, and L-SPC cells were stained with immunofluorescence.