ビタミンK依存性凝固因子のプロセシングプロテアーゼの構造と機能解析

维生素K依赖性凝血因子加工蛋白酶的结构和功能分析

• 批准号: 05680527
• 负责人: 川畑 俊一郎
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05680527/
• 关键词: ビタミンK依存性凝固因子; プロセシングプロテアーゼ; メタルプロテアーゼ; エンドペプチターゼ 24-15

本研究では、ビタミンK依存性凝固因子のプロセシング機構を解明することを目的とし、メタルエンドペプチダーゼ(MEP)の全一次構造をそのcDNAをクローン化することによって決定した。MEPのcDNAには、3つの開始メチオニンの候補が存在するが、MEPのアミノ末端配列が不明であるため、真の開始メチオニンは特定できなかった。最も小さい読み枠でもその分子量は80、0688と計算され、SDS-PAGEで推定された値(70、000)よりも大きく、翻訳後にアミノ末端あるいは、カルボキシ末端領域で切断を受けることが考えられた。MEPには分泌タンパク質に見られるアミノ末端のシグナクル配列がなく、ハイドロパシープロットからも全体的に親水的で、膜結合や膜貫通ドメインは存在せず、その細胞内局存性を明らかにする必要があった。Genbank を用いてホモロジー検索を行なったところ、有意な相同性を示すタンパク質が見いだされた。なかでもラットtestesメタルエンドペプチターゼ24.15は、MEPと60%という非常に高い相同性を示した。この酵素は、脳、脳下垂体,testesに多く発現しており、ネオエンドルフィン、ダイノルフィンなどからエンケファリンを生成させる際に働くペプチダーセである。一方、MEPはダイノルフィンに対しては反応しないが、その高い相同性から両者の関連性に興味が持たれ、現在、詳しいMEPの酵素特異性を各種のペプチドホルモンを用いて調べている。さらに、MEPのアミノ末端領域約33、000に相当するcDNAをPCRで増幅し、そのヌクレオチド配列を確認後、発現ベクターに組み込み大腸菌で発現させた。その結果、2Lの培養系で約300-500mu gのタンパク質が得られた。この組み替えタンパク質を抗原として、ニワトリを用いて抗体を作成し、MEPの組織特異的発現を調べた。その結果、MEPは、肝臓、賢臓、肺、胃、脳などに多く発現しており、特に表皮細胞に局在していることが判明した。現在、インムノゴールドを用いた電子顕微鏡により、MEPの細胞内局在性を解析中である。

In this study, we investigated the mechanism of K-dependent coagulation factors in order to determine the overall primary structure of MEP. MEP's cDNA sequence is unknown, and MEP's start sequence is specific. The molecular weight of the most important part is 80, 0688, calculated by SDS-PAGE, estimated by MEP is essential for the secretion of essential substances, such as the end of the molecule, the molecule, the end of the molecule, the end of the molecule, the Genbank is used to identify and identify individuals. 24.15. MEP 60% is highly consistent. This enzyme is produced in many ways, such as in the protophore, protophore and protophore. On the one hand, MEP has a high degree of similarity with each other, and on the other hand, it has a high degree of similarity with each other. On the other hand, MEP has a high degree of affinity with each other, and on the other hand, it has a high degree of similarity with each other. In addition, MEP gene expression in the terminal region of approximately 33,000 bp was amplified by PCR, and the expression of E. coli was detected after confirmation of the sequence. As a result, 2L of culture system was about 300-500mu g. The tissue specific expression of MEP is modulated by the production of anti-MEPs. The results of MEP, liver, kidney, lung, stomach, kidney, kidney Now, in the middle of the electronic microscope, MEP is in the middle of the analysis.

项目成果

Ikura,T.: "Secondary Structural Features of Modules M2 and M3 of Barnase in Solution by NMR Experiment and Distance Geometry Calculation." Proteins. 16. 341-356 (1993)

Ikura,T.：“通过 NMR 实验和距离几何计算研究溶液中 Barnase 模块 M2 和 M3 的二级结构特征。”

Kawabata,S.: "A microsomal endopeptidase from liver with substrare specificity for processing proproteins such as the vitamin K-dependent proteins of plasma." The Journal of Biological Chemistry. 267. 10331-10336 (1992)

Kawabata,S.：“一种来自肝脏的微粒体内肽酶，具有处理蛋白质前体（例如血浆维生素 K 依赖性蛋白质）的特异性。”

Sakumi,K.: "Cloning Expression of cDNA for a Human Enzyme That Hydrolyzes 8-Oxo-dGTP, a Mutagenic Substrate for DNA Synthesis." The Journal of Biological Chemistry. 268. 23524-23530 (1993)

Sakumi,K.：“水解 8-Oxo-dGTP（一种用于 DNA 合成的诱变底物）的人类酶 cDNA 的克隆表达。”

Kawabata,S.: "Rabbit liver microsomal endopeptidase with substrate specificety for processing proproteins is structurally related to rat testes metalloendopeptidase 24.15." The Journal of Biological Chemistry. 268. 12498-12503 (1993)

Kawabata,S.：“具有处理前蛋白底物特异性的兔肝微粒体内肽酶在结构上与大鼠睾丸金属内肽酶 24.15 相关。”

Miura,Y.: "A Limulus Intracelluar Coagulation Inhibitor with Characteristics of the Serpin Superfamily, Purification,Characterization,and cDNA Cloning." The Journal of Biological Chemistry. 269. 542-547 (1994)

Miura,Y.：“一种鲎细胞内凝血抑制剂，具有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族的特征、纯化、表征和 cDNA 克隆。”