リガンド依存的に会合制御が可能なセンサーペプチドの創製

创建可以以配体依赖性方式控制缔合的传感器肽

• 批准号: 14655303
• 负责人: 上田 宏
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14655303/
• 关键词: ファージディプレイ; 抗体; 可変領域; ペプチド; コンビナトリアル変異; 蛋白質間相互作用; ターミネーター

1.繊維状ファージを用いた新規な蛋白質間相互作用測定系の改良ファージに二種類の蛋白質の片方のみを提示し,片方を分泌型蛋白質として産生させ両者の間の相互作用を測定することができる新規蛋白質間相互作用測定系split Fv (spFv)システムを構築した.これを抗体の可変領域を構成する二つのドメイン(H鎖可変領域VHおよびL鎖可変領域VL)間の相互作用測定に応用したところ,確かに抗原添加に伴う相互作用変化を測定でき,またファージ産生ホストとしてアンバーサプレッサー変異株を用いることで,二つのドメインVH, VL両者を同時に提示し,可変領域としての抗原結合能を評価することも出来た.しかしこれをライブラリからの抗原結合クローンの濃縮に用いた場合,しばしば発現産物の細胞毒性によるとみられる遺伝子の欠落が起こったため,ベクター上にコードされる遺伝子の上流および下流に2個のグルタミンパーメアーゼ由来ターミネーターを挿入したところ,遺伝子の安定性に顕著な改善が見られた.よって以後このベクターを用いてライブラリからの選択をおこなった.2.SpFvシステムを用いた,抗体可変領域の安定性を決める残基の同定リガンド依存的に会合制御が可能なペプチドのモデルとして,抗原依存的に会合制御が可能なリゾチーム抗体HyHEL-10のVH/VL界面に存在するFR2領域に着目し,この部分のアミノ酸配列のうち抗原依存的な会合を示さない抗体D1.3において異なる計13残基をHyHEL-10型およびD1.3型にしたライブラリを作製しそのVH/VL相互作用および抗原結合能への影響を考察した.この結果,VH/VLの抗原依存的結合に決定的な役割を果たす残基(H39)が同定され,また抗原結合能とVH/VL相互作用との関係について包括的な知見を得ることができた(増田ら,化学工学会第68年会発表予定,投稿準備中).

1. New Protein-Protein Interaction Assay System for the Determination of Interactions between Secreted Proteins and Secreted Proteins: An Improved Protein-Protein Interaction Assay System Split Fv (spFv) System The antibody can be divided into two parts.(H lock variable domain VH and L lock variable domain VL) interaction determination is used to determine the interaction between antigen addition and interaction determination, and to determine the interaction between antigen addition and interaction determination. In the case of concentration of antigen binding protein, the cytotoxicity of the product is detected, and the stability of the protein is improved. 2. The stability of antibody domain is determined by the identity of residues in the domain dependent on the binding mechanism. The binding mechanism of antigen dependent residues in the domain dependent on the binding mechanism. The effects of the 13 residues of HyHEL-10 and D1.3 on the VH/VL interaction and antigen binding energy were investigated. As a result, the amino acid residue (H39) that determines the antigen-dependent binding of VH/VL was identified, and the relationship between antigen binding energy and VH/VL interaction, including knowledge, was identified (Tsuda, 68th Annual Meeting of the Chinese Society of Chemical Engineering, table scheduled, submission in preparation).

项目成果

T.Aburatani, H.Ueda, T.Nagamune: "Importance of a CDR H3 basal residue in V_H/V_L interaction of human antibodies"Journal of Biochemistry. 132・5. 775-782 (2002)

T.Aburatani、H.Ueda、T.Nagamune：“CDR H3 基础残基在人抗体 V_H/V_L 相互作用中的重要性”《生物化学杂志》132・5（2002 年）。

上田 宏: "化学フロンティア9「コンビナトリアルバイオエンジニアリング」"化学同人. 6 (2003)

上田浩：“化学前沿 9“组合生物工程””化学同人 6（2003）。

H.Ueda: "Open sandwich immunoassay : a novel immunoassay approach based on the interchain interaction of an antibody variable region"Journal of Bioscience and Bioengineering. 94・6. 614-619 (2002)

H.Ueda：“开放夹心免疫测定：基于抗体可变区链间相互作用的新型免疫测定方法”《生物科学与生物工程杂志》94·6（2002）。