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抗リン酸化ペプチド抗体を用いた細胞周期制御機構の可視化

使用抗磷酸化肽抗体可视化细胞周期控制机制

基本信息

批准号：
20058009
负责人：
上田宏
金额：
$ 3.07万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2008
资助国家：
日本
起止时间：
2008 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本年度は(1)FRET法による細胞骨格微小管蛋白ビメンチンのリン酸化検出プローブの最適化,ならびに(2)抗体可変領域の抗原による安定化を利用した新規イメージング法の開発を目標に研究を行った。(1)では前年度に得られた、細胞周期によりそのリン酸化が制御されるビメンチンのセリン71リン酸化認識抗体TM71発現系を用い、オープンサンドイッチ(OS)法によるリン酸化検出を試みた。VH/VL相互作用に影響を与えるH39への変異導入によりOS-ELISAの応答性(S/B比)が顕著に向上したため,この変異体VHならびにVLをTrx融合蛋白質として酸化的細胞質を持つ大腸菌で発現させ,それぞれAlexa488とRhodamineXで蛍光ラベルし混合して試験管内で蛍光スペクトルを測定した。この結果,抗原ペプチド依存的な最大18%の蛍光強度比変化が得られた。これを電気穿孔法によりU251細胞に導入し,高感度カメラを用いて蛍光顕微鏡観察したところcleavage furrowへの局在と若干のFRET比の変化が見られた。現在各種条件で追試を行っている。(2)では,抗原結合により蛍光強度が増強する新規蛍光ラベル化抗体"Quenchbody"の開発に成功した。具体的には,無細胞タンパク質合成系を用いて抗体VHのN末端近傍に蛍光ラベルをピンポイント導入することで,複数の低分子抗原認識FvあるいはscFvにおいて共存する抗原濃度依存的に蛍光強度が最大6倍増大する現象を発見した。メカニズムは現在解析中であるが,VH/VL界面に存在する複数のTrp残基の変異で抗原非存在時の蛍光強度が増大することから,これらの残基による蛍光のクエンチが重要であり,これが抗原結合に伴うFv安定化により解消することが考えられる。FRET法に比べて応答性に優れるこの方法を,今後各種細胞内リン酸化検出系に応用していきたい。

This year, we conducted research on (1) optimization of cellular microtubule protein expression by FRET method,(2) stabilization of antigen expression in antibody domain, and (3) development of new FRET method. (1)In the past year, the production of TM71 antibody was tested by the method of cell cycle analysis, cell cycle analysis, and cell cycle analysis. VH/VL interaction affects the differential introduction of H39 and OS-ELISA response (S/B ratio), which varies from VH to VL to Trx fusion protein to acidified cytoplasm to E. coli production, including Alexa488 and RhodamineX light mixing assay in vitro. As a result, a maximum of 18% of antigen-dependent fluorescence intensity ratio was obtained. This method was introduced into U251 cells, and high sensitivity was observed by light microscopy. Now all kinds of conditions are pursued. (2)Therefore, the development of a new antigen-binding antibody "Quenchbody" was successful due to the increase in the intensity of antigen-binding light. Specifically, cell-free protein synthesis system was used to introduce light near the N-terminal region of VH antibody, and multiple low molecular antigen recognition Fv, including scFv, was found to increase light intensity by a maximum of 6-fold depending on antigen concentration. In the present analysis, the presence of a plurality of Trp residues at the VH/VL interface and the increase in fluorescence intensity in the absence of antigen are important for antigen binding and Fv stabilization. The FRET method is more sensitive than the other methods. In the future, various intracellular acidification systems will be used.