高温環境で熱エネルギーに依存した活性を示すDNA ligaseの研究

在高温环境下表现出热能依赖性活性的DNA连接酶的研究

• 批准号: 14655308
• 负责人: 今中 忠行
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14655308/
• 关键词: DNA ligase; 耐熱性; ATP; AMP; 超好熱菌; 始原菌; DNA; 補酵素

我々は、超好熱始原菌Thermococcus kodakaraensis KOD1のDNA ligase (Tk-Lig)について詳細な生化学的解析を行うことにした。Tk-Ligの反応特性について検討した結果、ATP、Mg^<2+>を添加した際に高いDNA ligase活性が観察された。本酵素は鋳型なしの活性は検出されなかったので、nickを有する二重鎖DNAを基質とすることが判明した。様々な温度領域におけるTk-Ligの活性を測定したところ、本酵素は35℃から100℃の間に顕著なDNA ligase活性を示した。また、基質DNAの長さについては、nickを中心として両端8bp以上の二重鎖DNA構造があればTk-Ligの基質となり得ることが判明した。様々な温度域でTk-Ligの補酵素特異性を検討したところ、驚くべきことに本酵素は高温領域でATPのみならず、AMP、NAD^+などを補酵素として機能し得ることが判明した。特にAMP依存型DNA ligase活性は顕著で、65℃から85℃という高温領域でのみ検出された。本活性は反応溶液のhexokinase処理、apyrase処理後も認められ、反応溶液中のATPの夾雑によるものではないことが示された。酵素溶液をpyrophosphate処理した結果、本活性は発現や精製段階における酵素のadenyl化によるものではないことも明らかとなった。さらにAMPを補酵素とした場合でもE-AMP複合体やDNA nickの5-phosphateへのAMP転移後のDNA-AMP複合体が確認できた。このことから、ATP依存型活性とAMP依存型活性の反応機構は同一の経路を辿ることが示唆された。常温環境ではnick sealing反応は吸熱反応であり、生成物が蓄積することはあり得ない。しかしながら、基質および生成物に対して微少熱量計を用いた解析を行った結果、高温環境では基質と生成物間のエネルギー差が変化することが判明した。

I 々 々, DNA ligase (Tk-Lig) of the superthermophilous Thermococcus kodakaraensis KOD1 に 々 て て て detailed な biochemical analysis を line う とに とに た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た た. Tk - Lig の anti 応 features に つ い て beg し 検 た results, ATP, Mg ^ 2 + < > add し を た に high い DNA ligase activity が 観 examine さ れ た. This enzyme は type where な し の active は 検 out さ れ な か っ た の で, Nick を have す る DNA double lock を matrix と す る こ と が.at し た. Others 々 な temperature field に お け る Tk - Lig の determination of active を し た と こ ろ 35 ℃, the enzyme は か ら 100 ℃ between の に 顕 the な DNA ligase activity を shown し た. ま た, long substrate DNA の さ に つ い て は, Nick を center と し て struck end more than 8 bp の double lock DNA structure が あ れ ば Tk - Lig の matrix と な り have る こ と が.at し た. Others 々 な temperature field で Tk - Lig の repair enzyme specificity を beg し 検 た と こ ろ, く べ き こ と に this enzyme は high temperature field で ATP の み な ら ず, AMP, NAD ^ + な ど を repair enzyme と し し て function to る こ と が.at し た. Trevor に AMP dependent type DNA ligase activity は 顕 で, 65 ℃ か ら 85 ℃ と い う で high temperature field の み 検 out さ れ た. This activity は anti 応 solution の hexokinase 処, apyrase 処 reason after も recognize め ら れ, anti 応 solution の ATP の clamp 雑 に よ る も の で は な い こ と が shown さ れ た. Enzyme solution を pyrophosphate 処 Richard し た results, the active は 発 now や refined Duan Jie に お け る enzyme の adenyl change に よ る も の で は な い こ と も Ming ら か と な っ た. さ ら に AMP を repair enzyme と し た occasions で も E - AMP complex や DNA Nick の 5 - phosphate へ の AMP planning move が composite の DNA - AMP confirm で き た. <s:1> <s:1> <s:1> と ら, ATP-dependent activity と, AMP-dependent activity <s:1> anti-応 mechanism <e:1>, the same <s:1> channel を, る る とが, とが and された indicate された. In a normal temperature environment, で な nick sealing is the opposite of 応 <e:1> heat absorption and 応であ <e:1>, and the が accumulation of products is する と と あ あ あ な な. し か し な が ら, matrix お よ び products に し seaborne て slightly less heat meter を with い た parsing line を っ た results, high temperature environment で は matrix と products between の エ ネ ル ギ ー poor が variations change す る こ と が.at し た.

项目成果

N.Maeda, T.Kanai, H.Atomi, T.Imanaka: "The unique pentagonal structure of an archaeal Rubisco is essential for its high thermostability"J.Biol.Chem.. 277(35). 31656-31662 (2002)

N.Maeda、T.Kanai、H.Atomi、T.Imanaka：“古细菌 Rubisco 的独特五边形结构对其高热稳定性至关重要”J.Biol.Chem.. 277(35)。

Tadayuki Imanaka, Haruyuki Atomi: "Catalyzing Hot Reactions : Enzymes from Hyperthermophilic Archaea"The Chemical Records. 2(3). 149-163 (2002)

Tadayuki Imanaka、Haruyuki Atomi：“催化热反应：来自超嗜热古细菌的酶”化学记录。

T.Fukui, Tomohiro Eguchi, H.Atomi, T.Imanaka: "A membrane-bound archaeal Lon protease displays ATP-independent proteolytic activity towards unfolded proteins along with ATP-dependent activity for folded proteins"J.Bacteriol.. 184(13). 3689-3698 (2002)

T.Fukui、Tomohiro Eguchi、H.Atomi、T.Imanaka：“膜结合的古细菌 Lon 蛋白酶对未折叠蛋白显示出 ATP 独立的蛋白水解活性，以及​​对折叠蛋白的 ATP 依赖性活性”J.Bacteriol.. 184(13)

M.Nakatani, S.Ezaki, H.Atomi, T.Imanaka: "Substrate recognition and fidelity of strand joining by an archaeal DNA ligase"Eur.J.Biochem.. 269(2). 650-656 (2002)

M.Nakatani、S.Ezaki、H.Atomi、T.Imanaka：“古细菌 DNA 连接酶的底物识别和链连接保真度”Eur.J.Biochem.. 269(2)。