神経細胞死におけるリソゾームシステインプロテアーゼの役割

溶酶体半胱氨酸蛋白酶在神经元细胞死亡中的作用

• 批准号: 05251219
• 负责人: 内山 安男
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Iwate Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1993
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1993 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05251219/
• 关键词: 脳虚血; 遅発性神経細胞死; アポトーシス; システインプロテアーゼ; 海馬CAI錐体細胞; PC12細胞; bcl-2; アポトーシスの回避

本年度の研究では以下の点に成果が得られてた。1)砂ネズミ前脳短時間虚血モデル(1)自家融解小体の形成:虚血後のCA1錐体細胞においてはシステイン系蛋白分解酵素として知られるカテプシンB,H,Lの抗体で染めだされるリソゾームの数と大きさが増す。特に、3日後になると、細胞質蛋白の分解シグナルとして知られるユビキチンを取り込んだリソゾームが多く現われる。このことは、錐体細胞において自家融解小体を盛んに形成して、細胞質の蛋白や構造を壊していること示唆している。(2)CA1錐体細胞の死:自家融解小体を形成する虚血3日後になると、錐体細胞は急激に萎縮する。そこで、核の変化をみる目的でin situ nick end labelingを行なった結果、虚血3日後になって初めて錐体細胞の核のDNAは断片化し、4日後になると断片化した核は錐体細胞の樹状突起にまで拡散することが分かった。この時期のCA1錐体細胞を電子顕微鏡的に観察すると、核のクロマチンが凝縮し、さらに、ミクログリアの周囲にはクロマチンが凝縮し、縮小した核を持ったアポトーシス小体が認められた。そこで、対照群、虚血1日、2日、3日、4日後のCA1錐体領域を含む海馬を切り出し、genomic DNAを抽出し、電気泳動したところ、4日後のサンプルにのみオリゴヌクレオゾームに断片化したDNAがみいだされた。さらに、変性した細胞の運命をみるために、グリファニア-レクチン(ミクログリアの染色)とDNAのnick end labelingの二重染色をした結果、虚血4日後に断片化したDNAを取り込んだミクログリアが多数みいだされた。これらの結果は、遅発性神経細胞死は壊死ではなくアポトーシスであることを示している(投稿中)2)アポトーシスの回避:私達は、1)の(2)の結果に注目し、アポトーシスを回避する因子を探索する目的で、in vitroの系で実験を試みた。原型癌遺伝子としてクローニングされたbcl-2は、リンパ球系細胞のアポトーシスを強力に阻止する。この遺伝子をPC12細胞に組み込んだ結果、無血清培地でもPC12細胞は細胞死に陥ることはなかった。さらに、興味あることは、無血清培地で死を回避されたPC12細胞はNGFが存在しないにもかかわらず神経突起を伸長し、神経様細胞に分化した(投稿中)。

This year's research has yielded the following key results. 1) Sand ネズミ前脳 short-term blood deficiency モデル (1) Formation of self-dissolved body: CA1 pyramidal cells after blood deficiency においてはシステイThe enzyme proteolytic enzymes of the として知られるカテプシンB, H, and L antibodies are stained and stained. It is known that the breakdown of cytoplasmic proteins after 3 days is knownられるユビキチンをtake り込んだリソゾームが多く成われる.このことは, pyramidal cell において own fusion body を生んに formation して, cytoplasmic のprotein や structure を壊していること Show 唆している. (2) Death of CA1 pyramidal cells: The formation of self-dissolved corpuscles will occur after 3 days of blood deficiency, and the pyramidal cells will shrink due to acute stimulation.そこで、心の変化をみるpurposeでin situ nick end Labelingを行なったResults, 3 days after blood deficiency, になって初めてPyramidal cell のnuclear のDNA は fragment After 4 days, the nuclei of the nuclei and the dendritic processes of the pyramidal cells were fragmented and the cells were divided into pieces. The CA1 pyramidal cells in this period were inspected by electron microscopy, and the nuclei were condensed, and the nuclei were condensed. The クログリアのweek囲にはクロマチンがcondensationし, the shrinking core をhold the small body がidentificationめられた.そこで,対毯群, CA1 cone field after 1, 2, 3, and 4 days of blood deficiency, including the hippocampus, cutting out, genomic DNA extraction, electrophoresis, and electrophoresis after 4 daysみオリゴヌクレオゾームに fragmented DNA がみいだされた.さらに, 変性した性的 Cell's destiny をみるために, グリファニア-レクチン(ミクログリアの staining) and DNAのnick end As a result of double staining of labeling, the fragmented DNA was obtained after 4 days of blood deficiency, and the DNA was extracted from the DNA.これらのRESULTは, 遅発性神経死は壊死ではなくアポトーシスであることをshow している (submitting) 2) アポトーシスのevasion: privy to は、1)の(2)のRESULTにAttentionし、アポトーシスをavoidance するfactorをExplorationするpurposeで、in The test of the in vitro system is the test. The prototypic cancer-related disease is caused by bcl-2, and the bcl-2 is a cancer-related disease. The results of the PC12 cell group and the serum-free PC12 cell death were determined.さらに, 心丝あることは, serum-free field で死をavoidance されたPC12 cells はNGFがThere is an elongation of the protrusions and the differentiation of the cells (under submission).

项目成果

Kominami,E.: "Portland Press,London" Lysosomal cysteine proteinases as a processing proteinases: Localization in secretory granules.In Proteolysis and protein turnover.ed,Bond,J.S.,Barrett,A.J.pp39-44 (1993)

Kominami，E.：“波特兰出版社，伦敦”溶酶体半胱氨酸蛋白酶作为加工蛋白酶：分泌颗粒中的定位。蛋白水解和蛋白质周转。ed，Bond，J.S.，Barrett，A.J.pp39-44（1993）

Sano,K.: "Co-existence of renin and carhepsin B in juvenile qranules of granular ductal cells of adult mice submandibular gland." J.Histochem.Cytochem.41. 433-438 (1993)

Sano,K.：“肾素和卡赫蛋白酶 B 在成年小鼠颌下腺颗粒导管细胞的幼年颗粒中共存。”

Hashizume,Y.: "Cysteine proteinases in rat parathyroid cells with special reference to their correlation with parathyroid hormone (PHT) in storage granules." J.Histochem.Cytochem.41. 273-282 (1993)

Hashizume,Y.：“大鼠甲状旁腺细胞中的半胱氨酸蛋白酶，特别是它们与储存颗粒中的甲状旁腺激素 (PHT) 的相关性。”

Asari,A.: "Localization of hyaluronic acid in human articular cartilage." J.Histochem.Cytochem. (in press).

Asari,A.：“透明质酸在人类关节软骨中的定位。”

Taniguchi,K.: "Cysteine proteinases in rat dorsal root ganglion and spinal cord,with special reference to the colocalization of these enzymes with calcitonin gene related peptide (CGRP) in Iysosomes." Brain Res. 601. 143-153 (1993)

Taniguchi, K.：“大鼠背根神经节和脊髓中的半胱氨酸蛋白酶，特别是这些酶与溶酶体中降钙素基因相关肽 (CGRP) 的共定位。”