次世代遺伝子治療の開発研究

下一代基因疗法的研究与开发

• 批准号: 14657187
• 负责人: 原 寿郎
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657187/
• 关键词: 遺伝子修復治療; オリゴヌクレオチド; GFP; hprt遺伝子; 部位特異的変異導入

1.変異GFP発現細胞を用いた遺伝子修復モデル(原・續・中津・酒井)ナンセンス変異を有する変異GFP発現プラスミド,およびその変異点に特異的なアンチセンス・オリゴヌクレオチド(45-mer)をHeLa,HT-1080,およびMCF-7細胞に導入した.オリゴヌクレオチドの導入条件としてS化修飾やオリゴヌクレオチド濃度,さらにプラスミドとオリゴヌクレオチドの加温処理(アニーリング反応)などの効果について検討したが,GFP(緑色)蛍光を復帰した細胞は得られなかった.2.hprt遺伝子の点変異導入(原・酒井)ダイレクトシークエンス法によってHT-1080細胞が野生型hprt遺伝子を有すること,またこの細胞が6-チオグアニン感受性であることを確認した.そこでhprt遺伝子内の標的部位にナンセンス変異(R51X)を誘発させる,45-merのオリゴヌクレオチドを設計し,HT-1080細胞に導入した.HT-1080母数あたりの6-チオグアニン耐性コロニー数を計測し,オリゴヌクレオチドによるhprt遺伝子の部位特異的な変異頻度を求めた.その結果,オリゴヌクレオチド導入後のhprt遺伝子の変異頻度(3.3x10^<-6>)は,自然突然変異頻度(2.5x10^<-6>)と同一レベルであった.また形成されたコロニーについて塩基配列を確認したが,オリゴヌクレオチドによる部位特異的な点変異は認めらなかった.3.種々のオリゴヌクレオチドの合成(佐々木)6位をニトロ化した修飾グアニンを含有するオリゴヌクレオチド(DNA)を化学的に合成し,水溶液中で相補鎖DNAと二本鎖を形成させたところ,修飾グアニンの対側のシトシンが容易にチミンに変化することを見いだした.

1. The cells with abnormal GFP expression were repaired using いた缝子 in the same factory Different GFP 稺プラスミド,およびその変different pointにSpecial なアンチセンス・オリゴヌクレオチド (45 -mer)をHeLa,HT-1080,およびMCF-7 cells are introduced into the system.オリゴヌクレオチドのImport conditions: やオリゴヌクレオチド concentration, さらにプラスミドとオリゴヌクレオチドのheating place (アニーリング濜) などの Effect について検検曰したが, GFP (green) 蛍光を综合帰したcell は得られなかった.2.hprt 伝子の点変 difference import (original Sakai) ダイレクトシークエンス法によってHT -1080 cells of wild-type hprt leftovers, cells of 6-1080 cells, and sensitivity of 1080 cellsることをconfirmationした.そこでhprtThe target part inside the ejaculationにナンセンス変different(R51X)をinducing発させる, 45-mer design, HT-1080 cell import, HT-1080 mother numberあたりの6-チオグアニンresistant コロニーnumをmeasurementし,オリゴヌクレオチドによるhprt伝子の部The bit-specific な変deviation frequency is the result of めた.その, and the オリゴヌクレオチド is imported and the のhprt remains 伝子の変deviation frequency ( 3.3x10^<-6>)は, naturally suddenly change the frequency (2.5x10^<-6>) and the same frequency.また Formation されたコロニーについて婩婩array をConfirmation したが, オリゴヌクレオチドによるPart-specific な point変different recognition めらなかった. 3. Kind of 々のオリゴヌクレオチドのsynthesis (Sasaki) 6-bit をニトロ化したmodificationグAmino contains するオリゴヌクレオチド (DNA), which is chemically synthesized and can complement and lock DNA in aqueous solution. Lock を formed させたところ, modified グアニンの対lateral のシトシンが easy にチミンに変化 することを见いだした.

项目成果

Fumi Nagatsugi: "Selective cross-linking to the adenine of the TA interrupting site within the triple helix"Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. 12・3. 487-489 (2002)

Fumi Nagatsugi：“与三螺旋内 TA 中断位点的腺嘌呤的选择性交联”《生物有机与药物化学快报》12・3（2002 年）。

Takehiko Inoue: "Contribution of the interleukin 4 gene to susceptibility to subacute sclerosing panecephalitis"Archive of Neurology. 59・5. 822-827 (2002)

Takehiko Inoue：“白细胞介素 4 基因对亚急性硬化性全脑炎的影响”，神经病学档案 59・5（2002 年）。

Torisu et al.: "Functional MxA promoter polymorphism associated with subacute sclerosing panencephalitis."Neurology. 62. 457-460 (2004)

Torisu 等人：“功能性 MxA 启动子多态性与亚急性硬化性全脑炎相关。”神经病学。

Nagatsugi et al.: "Efficient cross-linking reactions by functional nucleobases capable of in situ activation under neutral conditions."Nucleic Acids Res Suppl.. (3). 155-156 (2003)

Nagatsugi 等人：“通过能够在中性条件下原位激活的功能性核碱基进行有效的交联反应。”Nucleic Acids Res Suppl.. (3)。

Sasaki et al.: "Selective formation of stable triplexes including a TA or a CG interrupting site with new bicyclic nucleoside analogs (WNA)"J.Am.Chem.Soc.. 126. 516-528 (2004)

Sasaki 等人：“用新的双环核苷类似物 (WNA) 选择性形成包括 TA 或 CG 中断位点的稳定三链体”J.Am.Chem.Soc.. 126. 516-528 (2004)