分子認識プロテオミクスを目的とする光キャプチャー法開発

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リガンドを固相上に配置した光アフィニティーアレイを構築し、光アフィニティー捕捉(光キャプチャー)した蛋白質を効率良く分離解析する、新しい光アフィニティー法の開拓を目的に、以下の萌芽期の研究計画を年度ごとに具体的に実行してきた。1)アレイ化には大量・多種のプローブが必要なため、これに見合うプローブ合成の効率化の検討。2)DNAアレイ化に比し、プロテオーム解析では蛋白質の非特異的吸着など、アレイ構築にさらに工夫が必要となる。このための新たなアレイ化技術の開拓。3)構築したアレイについての、応用系での検証。初年度および昨年度において、主に1)、2)について検討し、アレイ化のモデル系をほぼ確立した。最終年度は、これらの実績を基に3)の応用系での検討を実施し、以下の成果を得た。1.糖鎖リガンドの効率的プローブ誘導化法を実際に応用し、Sophora japonicaから得られるレクチンのsophoragrinにおける、糖鎖結合サブユニットを明らかにした。2.光キャプチャーは、解析対象のタンパク質のみを釣り上げ、固相上で連続洗浄できるため操作性に優れる。しかし、捕捉・精製した資料をMS解析系に移行させるには、固相から再遊離させる必要がある。この段階につき、アビジン-ビオチン系で化学的方法と酵素法を検討した。a)昨年度に確立した光反応性のフェニルアラニンを用い、光反応性ペプチドのカルモジュリンを合成し、切断性ジスルフィド結合型のビオチンを組み込んで検討した。その結果、アビジン捕捉状態では、ジスルフィド結合開裂が妨げられる場合があることが分かった。b)この解決のため、プロテアーゼ切断性のペプチド型スペーサーを開発し、タンパク質に影響を与えずビオチンを切断してアビジン捕捉試料を回収する可能性を示した。3.遊離させた試料を効率良くMS解析するため、効率の良い安定同位体標識条件を見出した。