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光反応性高次認識糖鎖分子の設計と応用

光反应高阶识别糖链分子的设计与应用

基本信息

批准号：
09240214
负责人：
畑中保丸
金额：
$ 0.9万
依托单位：
Toyama Medical and Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

【平成9年度の研究実績概要】光アフィニティーラベルは、ラベル試薬の合成から、蛋白質の量的確保、ラベル後の消化・精製・配列解析までのマラソン型研究である。従って化学的構造生物学推進のためには、この過程の効率化は、今や最大の課題である。我々は、高速化のポイントを非放射性プローブの導入と、ラベル生成物の精製に費やす、膨大な時間の短縮に絞って検討した。我々がすでに開発に成功した、ビオチンを搭載する新型光アフィニティープローブは、この問題解決には極めて有効で、容易にかつ特異的にビオチンタグを導入する新しい方法論が可能となる。本年度は、この「光アフィニティービオチン化」のノウハウ蓄積を主眼に、その開発と応用に取り組んだ。このプローブがウシガラクトース転位酵素(GalT)を特異的にラベルすることは確認していたので、ラベル部位解析のスピードアップに、ビオチンタグをフルに活用した新しいアプローチを検討した。ラベル蛋白質の分離と非ラベルGalTの再利用に固定化アビジンを利用し、ラベル蛋白質の消化過程で疎水性断片が容器に吸着して損失するのを防ぐため、PVDF′(polyvinylidene difluoride)膜上で微量消化した。さらに、HPLCで分離後のペプチド断片を膜に固定化できるアミノPVDF膜を開発し、ラベルピークが化学発光操作中に溶出するのを防ぎ、ピーク検出上の問題点をクリア-した。この結果、消化混合物中から化学発光ポジティブなピーク検出に成功し、この発光がアビジンでブロックされることからGalTのラベル部位としてTyr^<197>-Arg^<208>を短期間で同定し、光アフィニティービオチン化の有効性を実証した。このアプローチは、最新の質量分析法と組み合わせて、さらに微量・高速化が可能であり、将来的には自動化も期待される。

【Summary of research achievements in FY2009】Hikari Fukuda, Hikari Fukuda, Hikari Fukuda, Ensuring the amount of protein, digesting, purifying, and arranging analysis of ラベル后 and conducting research on the type of protein. The structural biology promotion project of 従ってchemistry, the efficiency improvement of the process, and the biggest project today. I have introduced high-speed non-radioactive radioactive materials, refined products, and expanded time and shortened time. I have succeeded in opening the new Hikaru, and I have a problem with the new Hikari Hikaru and Hikaru. It is possible to solve the problem of effective and easy way of solving the problem of special method of introducing new method. This year, the main eye of the main eye is the main eye of the "light アフィニティービオチン化", and the その开発と応用にtakingりgroup is the んだ. GalT enzyme (GalT) specific enzyme , ラベル Part Analysis のスピードアップに, ビオチンタグをフルにutilization した新しいアプローチを検 Discussion した. Isolation of ラベル protein, recycling of non-ラベルGalT, immobilization of アビジンを utilization, digestion of ラベル protein PVDF′(polyvinylidene) Difluoride) is microdigested on the membrane.さらに, HPLC separation of the fragmented membrane and immobilization of the PVDF membrane, The problem of dissolution during the chemical treatment of ラベルピークが and the problem of ピーク検をクリア-した. The result of the digestion mixture is chemical 発光ポジティブなピーク検出にSuccessし、この発光がアビジンでブロックされることからGalTのThe ラベル location is the same as the short-term Tyr^<197>-Arg^<208>, and the effectiveness of the light アフィニティービオチン is confirmed by the short-term で同定し. The latest mass spectrometry method, the combination of the latest quality analysis method, the possibility of micro-volume and high speed, and the expectation of future automation.